La apertura y el cierre del canal de cloruro regulador de conductancia transmembrana de fibrosis Quística (CFTR) son controlados por la Unión de ATP y la hidrólisis por sus dominios de unión de nucleótidos (NBDs). Se presume que esto controla la apertura de una sola «puerta» dentro de la vía de permeación, sin embargo, la ubicación de dicha puerta no se ha descrito., Utilizamos el registro de pinza de parche para monitorear el acceso de reactivos de cisteína citosólica a cisteínas introducidas en diferentes regiones transmembrana (TM) en una forma de CFTR sin cisteína. La tasa de modificación de los iones Q98C (TM1) e I344C (TM6) por metanotiosulfonato (MTSES) y permeante Au(CN)2 se redujo cuando la concentración de ATP se redujo de 1 mM a 10 µM, y la modificación por MTSES se aceleró cuando se aplicó pirofosfato de 2 mM para evitar el cierre del canal. La modificación de K95C (TM1) y V345C (TM6) no se vio afectada por estas maniobras., También manipulamos el gating introduciendo las mutaciones K464A (en NBD1) y E1371Q (en NBD2). La tasa de modificación de Q98C e I344C por MTSES y Au(CN)2− se redujo en K464A y aumentó en E1371Q, mientras que la modificación de K95C y V345C no se vio afectada. Estos resultados sugieren que el acceso desde el citoplasma a K95 y V345 es similar en canales abiertos y cerrados. En contraste, la modificación de la compuerta del canal dependiente de ATP altera el acceso a Q98 e I344, ubicados más adentro del poro., Proponemos que la compuerta dependiente de ATP de CFTR se asocia con la apertura y el cierre de una puerta dentro de la vía de permeación a nivel de estos aminoácidos que recubren los poros.