históricamente, se han descubierto nuevos medicamentos a través de la selección aleatoria de ingredientes activos de fuentes naturales y luego la validación de las hits para la actividad en modelos animales. El cribado, como su nombre lo indica, es un proceso de tamizado para encontrar los pocos compuestos en un conjunto grande que tienen una actividad biológica deseada., La premisa básica del cribado es que los ensayos biológicos son reproducibles, confiables, robustos y biológicamente relevantes. Enzo ofrece una línea de productos y servicios que pueden acelerar su programa de descubrimiento de medicamentos. Nuestro objetivo es ofrecer herramientas innovadoras que hagan que el desarrollo de medicamentos sea más eficiente, más rentable y más exitoso.
definición de ensayos biológicos
un ensayo es un procedimiento de medición analítica definido por un conjunto de reactivos que produce una señal detectable para cuantificar un proceso biológico., La calidad de un ensayo se define por la robustez y reproducibilidad de la señal en ausencia de un compuesto de ensayo. La calidad del ensayo depende del tipo de señal medida y esta podría ser absorbancia, fluorescencia, luminiscencia, radiactividad, etc. Los reactivos, las condiciones de reacción, la instrumentación de automatización, así como los modelos estadísticos para el análisis de datos también desempeñan un papel en la definición de la calidad del ensayo. La calidad del ensayo y la calidad de los datos recogidos influyen en el análisis predictivo de las actividades biológicas y farmacológicas de un compuesto.,
cribado, desarrollo del ensayo y validación
el desarrollo del ensayo es un método objetivo para el cribado de compuestos putativos para determinar la interacción o modificación del objetivo. Tener una mejor comprensión de las vías específicas involucradas en la etiología de la enfermedad ayuda a los investigadores a desarrollar ensayos más completos utilizando herramientas y tecnologías emergentes. Durante la fase de diseño, se seleccionan las condiciones y procedimientos de ensayo para minimizar las fuentes potenciales. Las tasas de aciertos falsos positivos y falsos negativos están relacionadas con la selectividad y sensibilidad de un ensayo., Un hit se define como la actividad consistente de una molécula en un ensayo bioquímico o basado en células y se expresa como un porcentaje de actividad en relación con los compuestos de control. El desarrollo del ensayo y el proceso de optimización se pueden considerar como un ciclo en el que se pueden probar varias variables y los parámetros que dan una mejor «ventana de lectura».»Los experimentos de optimización dependen de la tecnología particular que se utilice., Un aspecto muy importante de la optimización es mejorar la reproducibilidad y el rendimiento estadístico del ensayo mediante la búsqueda de condiciones que aumenten la relación señal-ruido con respecto a los controles positivos y negativos, y disminuir las variaciones entre pocillos que se producen debido a errores de pipeteo y gradientes de temperatura a través de la placa de microtiter. En general, es deseable un coeficiente de variaciones inferior al 10% y valores Z superiores a 0,5. La validación del ensayo demuestra que el ensayo es aceptable para su finalidad prevista., La validación rigurosa es crítica teniendo en cuenta que se espera que los ensayos funcionen de manera robusta durante varios años durante el desarrollo preclínico. Un ensayo robusto requiere que la señal medida sea capaz de proporcionar datos biológicamente relevantes.a partir de un conjunto de compuestos potenciales, se generan unas pocas pistas seleccionadas que demuestran una relación entre la estructura química y la actividad basada en el objetivo en un ensayo bioquímico o celular. Los compuestos potenciales se examinan mediante ensayos de unión, funcionales, bioquímicos y celulares o de citotoxicidad., El cribado de alto rendimiento a través de una gran biblioteca de compuestos puede identificar múltiples compuestos. La progresión a un compuesto(S) de plomo implica ensayos celulares, ensayos toxicológicos, sustitutos biofarmacológicos para la absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME).
tipos de ensayos
los ensayos pueden ser procedimientos libres de células (bioquímicos) o basados en células. La elección de un ensayo bioquímico o basado en células junto con el formato de detección particular es una cuestión de preferencia., Los ensayos basados en células no solo obtienen potencias de compuestos, sino que también detectan citotoxicidad, permeabilidad y efectos sobre el crecimiento al mismo tiempo, lo que puede ser visto como predictores para el desarrollo tardío. Los ensayos basados en células representaron un mayor éxito en la identificación de nuevas clases de drogas en los últimos años y, por lo tanto, se han vuelto más favorables. Enzo Life Sciences ofrece una amplia cartera de productos para el análisis de células vivas., Nuestra plataforma de ensayos CELLESTIAL ® ofrece ensayos de células vivas basados en fluorescencia que son sensibles, altamente específicos y optimizados para las aplicaciones de imágenes más exigentes, incluyendo cribado de alto contenido basado en microplacas, citometría de flujo, microscopía confocal y microscopía de fluorescencia de amplio campo donde la consistencia y la reproducibilidad son esenciales. Del mismo modo, las enzimas son importantes dianas farmacológicas y los medicamentos comercializados funcionan a través de la inhibición de enzimas mediadoras de fenotipos de enfermedades. Es fundamental tener un conocimiento profundo de la bioquímica enzimática y la cinética de la acción enzimática., Nuestras décadas de experiencia en el diseño y fabricación de enzimas activas y sus sustratos apoyan el desarrollo de una cartera de ensayos bioquímicos en constante expansión. Nuestro menú de ensayos de actividad enzimática escalable se basa en nuestros kits de ensayo MMP y Caspase Drug Discovery.
formatos comunes de ensayo y detección
una variedad de métodos de detección de ensayo, como colorimetría, fluorescencia, bioluminiscencia y transferencia de energía de resonancia (FRET) son métodos de elección para las lecturas de placas., Los métodos de fluorescencia proporcionan enfoques más sensibles para la detección de moduladores moleculares pequeños, ya que tienen la ventaja de un fondo bajo, además de una mejor señal a ruido. Enzo ofrece ensayos de actividad colorimétrica y fluorométrica de alta sensibilidad para la detección de inhibidores de MMP, caspasa y colagenasa y gelatinasa, así como enzimas altamente activas y anticuerpos específicos para proyectos de descubrimiento de fármacos., Estos ensayos ejemplifican la sinergia de las capacidades de Enzo, el ensamblaje de pequeños péptidos, la síntesis activa de proteínas recombinantes, el etiquetado fluorescente y las tecnologías de detección, y el desarrollo de anticuerpos en kits de ensayo robustos y reproducibles.el cribado de alto rendimiento (HTS) es la prueba iterativa de diferentes compuestos en un ensayo. Una pantalla se considera generalmente de alto rendimiento si puede analizar > 10.000 ensayos (pocillos) por día., HTS permite a un investigador realizar rápidamente millones de pruebas e identificar rápidamente genes modificadores relevantes, proteínas o compuestos involucrados en una vía biológica específica. Los resultados de estas pantallas típicamente identifican nuevos objetivos de drogas o actividades de drogas en un solo objetivo y pueden revelar relaciones estructura-función en «golpes» de moléculas pequeñas y agrupamiento funcional dentro de las vías biológicas. Enzo Life Sciences tiene un largo y exitoso historial de métodos listos para usar para la detección de compuestos a través de una colección enfocada de bibliotecas de compuestos únicas.,los sistemas de detección In vitro y la detección de alto rendimiento han ayudado en gran medida a mejorar la eficiencia de la detección de medicamentos en el proceso moderno de descubrimiento de medicamentos. Antes del advenimiento de estas tecnologías, el cribado de compuestos candidatos para la actividad biológica era un cuello de botella importante en la identificación de nuevas terapias.
Figura 1: Enzo ofrece una línea de productos que pueden acelerar su programa de descubrimiento de fármacos.,
Los avances en el aislamiento celular, la generación de líneas celulares y las tecnologías de diferenciación celular han llevado a modelos celulares más escalables y asequibles, que a su vez facilitan el cribado utilizando modelos celulares más fisiológicamente relevantes. Debido a su naturaleza rica en información, el cribado de alto contenido (HCS) se ha convertido en la opción para que los científicos examinen los efectos complejos de los compuestos en modelos y vías celulares fisiológicamente relevantes. HCS se puede utilizar para detectar y supervisar la agregación de proteínas., Para monitorear la agregación de proteínas, Enzo Life Sciences ha desarrollado una detección robusta y cuantitativa de los agresomas para acelerar el estudio de las enfermedades neurodegenerativas, las enfermedades hepáticas y la toxicología. Las formulaciones terapéuticas de proteínas a menudo están plagadas de problemas con la agregación de proteínas. Desafortunadamente, el monitoreo y la identificación de estas partículas ha sido difícil y se limita a la cromatografía de exclusión de tamaño y la electroforesis en gel nativa., En este estudio, la citometría de flujo y los colorantes específicos de los agregados proteicos (PROTEOSTAT®) o las gotas de aceite se utilizan en combinación para identificar partículas en una formulación terapéutica y evaluar el tamaño de estas partículas.
Figura 2: la agregación PROTEOSTAT® ofrece una detección superior de agregados proteicos sub-visibles en comparación con los tintes convencionales.,
Figura 3: rango dinámico lineal efectivo para la detección de agregados de anticuerpos utilizando el reactivo de detección PROTEOSTAT ® comparado con la Tioflavina T. Los valores relativos de la unidad de fluorescencia (RFUs) pueden diferir dependiendo del lector de microplacas empleado para el análisis.
Enzo ofrece una gama de productos para ayudarlo a monitorear la integridad del producto y maximizar el rendimiento, incluidos kits ELISA altamente sensibles y reproducibles., Nuestro kit ELISA de proteína A es un inmunoensayo sándwich sensible y reproducible para cuantificar los residuos de proteína A en preparaciones de anticuerpos monoclonales. Este kit ELISA ampliamente validado permite la detección eficiente de construcciones de proteína a natural y recombinante con una recuperación de hasta el 100%. Nuestro kit de E. coli host cell protein Elisa es ideal para análisis de impurezas, cuantificación de proteínas de células anfitrionas y Western blots.
Figura 4: El kit ELISA de proteína a reconoce todos los constructos de proteína a comúnmente utilizados.,
las técnicas básicas enumeradas anteriormente proporcionan una visión general de los ensayos en discovery hoy. Pero todos ofrecen ventajas y desventajas. A medida que nuestra comprensión de los procesos biológicos subyacentes a la enfermedad avanza, existe una necesidad continua de desarrollar nuevas técnicas y ensayos para dar cuenta de estos sistemas cada vez más complejos., Desde nuestra familia de productos insignia SCREEN-WELL® Compound library de larga data hasta nuestra compleja cartera CELLESTIAL® de sondas fluorescentes y kits de ensayo para análisis celular, Enzo Life Sciences ofrece una amplia variedad de productos para sus necesidades de descubrimiento de fármacos. Nuestras décadas de experiencia en el diseño y fabricación de enzimas activas y sus sustratos apoyan el desarrollo de una cartera de ensayos bioquímicos en constante expansión. Consulte nuestros consejos de investigación exitosa o no dude en ponerse en contacto con nuestro servicio de soporte técnico para obtener más ayuda.