Storicamente, nuovi farmaci sono stati scoperti attraverso lo screening casuale di principi attivi da fonti naturali e quindi la convalida dei colpi per l’attività in modelli animali. Lo screening, come suggerisce il nome, è un processo di vagliatura per trovare i pochi composti in un grande insieme che hanno un’attività biologica desiderata., La premessa di base dello screening è che i saggi biologici sono riproducibili, affidabili e robusti e biologicamente rilevanti. Enzo offre una linea di prodotti e servizi in grado di accelerare il vostro programma di scoperta di farmaci. Il nostro obiettivo è fornire strumenti innovativi che rendano lo sviluppo di farmaci più efficiente, più economico e più efficace.
Definizione di saggi biologici
Un saggio è una procedura di misura analitica definita da un insieme di reagenti che produce un segnale rilevabile per quantificare un processo biologico., La qualità di un saggio è definita dalla robustezza e riproducibilità del segnale in assenza di un composto di prova. La qualità del saggio dipende dal tipo di segnale misurato e questo potrebbe essere assorbanza, fluorescenza, luminescenza, radioattività, ecc. Anche i reagenti, le condizioni di reazione, la strumentazione di automazione e i modelli statistici per l’analisi dei dati svolgono un ruolo nella definizione della qualità del dosaggio. La qualità del saggio e la qualità dei dati raccolti influenzano l’analisi predittiva delle attività biologiche e farmacologiche di un composto.,
Screening, sviluppo del test e validazione
Lo sviluppo del test è un metodo oggettivo per lo screening di composti putativi per determinare l’interazione o la modifica del bersaglio. Avere una migliore comprensione dei percorsi specifici coinvolti nell’eziologia della malattia aiuta i ricercatori a sviluppare saggi più completi utilizzando strumenti e tecnologie emergenti. Durante la fase di progettazione, vengono selezionate le condizioni e le procedure di dosaggio per ridurre al minimo le potenziali fonti. I tassi di successo falsi positivi e falsi negativi sono correlati alla selettività e alla sensibilità di un test., Un hit è definito come attività coerente di una molecola in un test biochimico o basato sulle cellule ed è espresso come attività percentuale rispetto ai composti di controllo. Processo di sviluppo e ottimizzazione Assay può essere pensato come un ciclo in cui diverse variabili possono essere testati e i parametri che danno una migliore “finestra di lettura.”Gli esperimenti di ottimizzazione dipendono dalla particolare tecnologia utilizzata., Un aspetto molto importante dell’ottimizzazione è quello di migliorare la riproducibilità e le prestazioni statistiche del test trovando condizioni che aumentano il rapporto segnale-rumore rispetto ai controlli positivi e negativi e di diminuire le variazioni inter-pozzo che si verificano a causa di errori di pipettaggio e gradienti di temperatura attraverso la piastra del microtitolo. In generale, sono desiderabili coefficienti di variazioni inferiori al 10% e valori Z superiori a 0,5. La convalida del test dimostra che il test è accettabile per lo scopo previsto., La convalida rigorosa è fondamentale considerando che i saggi dovrebbero funzionare in modo robusto per diversi anni durante lo sviluppo preclinico. Un saggio robusto richiede che il segnale misurato sia in grado di fornire dati biologicamente rilevanti.
Da un pool di potenziali composti, vengono generati alcuni lead selezionati che dimostrano una relazione tra struttura chimica e attività basata su target in un test biochimico o basato su cellule. I potenziali composti sono sottoposti a screening attraverso saggi di legame, funzionali, biochimici e cellulari o di citotossicità., Lo screening ad alta produttività attraverso una vasta libreria di composti può identificare più composti. La progressione ad un composto del cavo comprende le analisi cellulari, le analisi tossicologiche, i surrogati biofarmacologici per assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione (ADME).
Tipi di saggi
I saggi possono essere senza cellule (biochimici) o procedure basate su cellule. La scelta di un test biochimico o basato su cellule insieme al particolare formato di rilevamento è una questione di preferenza., I saggi cellulari non solo ottengono potenze di composti, ma rilevano anche citotossicità, permeabilità ed effetti sulla crescita allo stesso tempo, che possono essere visti come predittori per lo sviluppo tardivo. I test basati sulle cellule hanno rappresentato un maggiore successo nell’identificare nuove classi di farmaci negli ultimi anni e sono quindi diventati più favorevoli. Enzo Life Sciences offre una gamma completa di prodotti per l’analisi cellulare dal vivo., La nostra piattaforma di analisi CELLESTIAL ® offre saggi di cellule vive a base di fluorescenza sensibili, altamente specifici e ottimizzati per le applicazioni di imaging più esigenti, tra cui screening ad alto contenuto basato su micropiastre, citometria a flusso, microscopia confocale e microscopia a fluorescenza a ampio campo in cui la coerenza e la riproducibilità sono essenziali. Allo stesso modo, gli enzimi sono importanti bersagli farmacologici e i farmaci commercializzati funzionano attraverso l’inibizione degli enzimi che mediano i fenotipi della malattia. È fondamentale avere una conoscenza approfondita della biochimica enzimatica e della cinetica dell’azione enzimatica., La nostra decennale esperienza nella progettazione e produzione di enzimi attivi e dei loro substrati supporta lo sviluppo di un portafoglio in continua espansione di saggi biochimici. Il nostro menu di saggi di attività enzimatica scalabile è ancorato dai nostri kit di test MMP e Caspase Drug Discovery.
Formati e rilevamento comuni
Una varietà di metodi di rilevamento del dosaggio, come colorimetrico, fluorescenza, bioluminescenza e trasferimento di energia di risonanza (FRET) sono metodi di scelta per le letture delle lastre., I metodi di fluorescenza forniscono approcci più sensibili allo screening di piccoli modulatori molecolari poiché hanno il vantaggio di un basso background oltre a un migliore segnale-rumore. Enzo offre test di attività colorimetrica e fluorometrica ad alta sensibilità per lo screening di inibitori di MMP, caspasi e collagenasi e gelatinasi, nonché enzimi altamente attivi e anticorpi specifici per progetti di scoperta di farmaci., Questi saggi esemplificano la sinergia delle capacità di Enzo, assemblando piccoli peptidi, sintesi proteica ricombinante attiva, tecnologie di etichettatura e rilevamento fluorescenti e sviluppo di anticorpi in kit di analisi robusti e riproducibili.
High-throughput screening (HTS) è il test iterativo di diversi composti in un test. Uno schermo è generalmente considerato un throughput elevato se può dosare > 10.000 saggi (pozzi) al giorno., HTS consente a un ricercatore di condurre rapidamente milioni di test e di identificare rapidamente i geni modificatori rilevanti, le proteine o i composti coinvolti in uno specifico percorso biologico. I risultati di questi schermi in genere identificano nuovi bersagli farmacologici o attività farmacologiche su un singolo bersaglio e possono svelare relazioni struttura-funzione in “colpi” di piccole molecole e clustering funzionale all’interno di percorsi biologici. Enzo Life Sciences ha una lunga esperienza di successo per i metodi pronti all’uso per lo screening dei composti attraverso una raccolta mirata di librerie di composti uniche.,
I sistemi di screening in vitro e lo screening ad alta produttività hanno notevolmente aiutato a migliorare l’efficienza dello screening dei farmaci nel moderno processo di scoperta dei farmaci. Prima dell’avvento di queste tecnologie, lo screening dei composti candidati per l’attività biologica era un importante collo di bottiglia nell’identificazione di nuove terapie.
Figura 1: Enzo offre una linea di prodotti in grado di accelerare il programma di scoperta dei farmaci.,
I progressi nell’isolamento cellulare, nella generazione di linee cellulari e nelle tecnologie di differenziazione cellulare hanno portato a modelli cellulari più scalabili e convenienti, che a loro volta facilitano lo screening utilizzando modelli cellulari più fisiologicamente rilevanti. Grazie alla sua natura ricca di informazioni, lo screening ad alto contenuto (HCS) è diventato la scelta per gli scienziati di esaminare gli effetti complessi dei composti in modelli e percorsi cellulari fisiologicamente rilevanti. HCS può essere utilizzato per rilevare e monitorare l’aggregazione delle proteine., Per monitorare l’aggregazione proteica, Enzo Life Sciences ha sviluppato una robusta rilevazione quantitativa degli aggresomi per accelerare lo studio delle malattie neurodegenerative, delle malattie epatiche e della tossicologia. Le formulazioni proteiche terapeutiche sono spesso afflitte da problemi di aggregazione proteica. Sfortunatamente, il monitoraggio e l’identificazione di queste particelle è stato difficile ed è limitato alla cromatografia ad esclusione delle dimensioni e all’elettroforesi su gel nativa., In questo studio, citometria a flusso e coloranti specifici per aggregati proteici (PROTEOSTAT®) o goccioline di olio vengono utilizzati in combinazione per identificare le particelle in una formulazione terapeutica e valutare le dimensioni di queste particelle.
Figura 2: PROTEOSTAT® Protein Aggregation offre un rilevamento superiore di aggregati proteici sub-visibili rispetto ai coloranti convenzionali.,
Figura 3: Efficace gamma dinamica lineare per anticorpi anti-aggregazione di rilevamento utilizzando PROTEOSTAT® Reagente di Rilevamento rispetto Thioflavin T. Relativa fluorescenza valori unitari (Rpu) possono differire a seconda del lettore di micropiastre impiegato per l’analisi.
Enzo offre una gamma di prodotti per aiutarti a monitorare l’integrità del prodotto e massimizzare la resa, inclusi kit ELISA altamente sensibili e riproducibili., Il nostro kit ELISA Protein A è un saggio immunologico sandwich sensibile e riproducibile per quantificare i residui di Proteina A nelle preparazioni di anticorpi monoclonali. Questo kit ELISA ampiamente convalidato consente un rilevamento efficiente di costrutti di proteine A naturali e ricombinanti con recupero fino al 100%. Il nostro corredo di ELISA della proteina della cellula ospite di E. coli è ideale per l’analisi dell’impurità, la quantificazione della proteina della cellula ospite e le macchie occidentali.
Figura 4: Il kit ELISA Protein A riconosce tutti i costrutti Protein A comunemente usati.,
Le tecniche di base sopra elencate forniscono una panoramica dei saggi in discovery oggi. Ma tutti offrono vantaggi e svantaggi. Man mano che la nostra comprensione dei processi biologici alla base della malattia avanza, c’è una continua necessità di sviluppare nuove tecniche e saggi per tenere conto di questi sistemi sempre più complessi., Dalla nostra famiglia di prodotti per la libreria di composti SCREEN-WELL® di lunga data al nostro complesso portafoglio CELLESTIAL® di sonde fluorescenti e kit di analisi per l’analisi cellulare, Enzo Life Sciences offre un’ampia varietà di prodotti per le vostre esigenze di scoperta di farmaci. La nostra decennale esperienza nella progettazione e produzione di enzimi attivi e dei loro substrati supporta lo sviluppo di un portafoglio in continua espansione di saggi biochimici. Si prega di consultare i nostri suggerimenti di ricerca di successo o non esitate a contattare il nostro servizio di supporto tecnico per ulteriore assistenza.