I dettagli di un esperimento di elettroforesi su gel di agarosio possono variare a seconda dei metodi, ma la maggior parte segue una procedura generale.

Fusione di gelEdit

Il gel viene preparato sciogliendo la polvere di agarosio in un tampone appropriato, come TAE o TBE, da utilizzare nell’elettroforesi. L’agarosio viene disperso nel tampone prima di riscaldarlo al punto di quasi ebollizione, ma evitare di bollire. L’agarosio fuso viene lasciato raffreddare sufficientemente prima di versare la soluzione in un getto poiché il getto può deformarsi o rompersi se la soluzione di agarosio è troppo calda. Un pettine viene inserito nel cast per creare pozzetti per il caricamento del campione e il gel deve essere completamente impostato prima dell’uso.

La concentrazione di gel influenza la risoluzione della separazione del DNA., Il gel di agarosio è composto da pori microscopici attraverso i quali le molecole viaggiano e c’è una relazione inversa tra la dimensione dei pori del gel di agarosio e la concentrazione – la dimensione dei pori diminuisce all’aumentare della densità delle fibre di agarosio. L’alta concentrazione del gel migliora la separazione delle più piccole molecole del DNA, mentre abbassando la concentrazione del gel permette che le grandi molecole del DNA siano separate. Il processo consente di separare frammenti che vanno da 50 coppie di basi a diverse basi mega a seconda della concentrazione di gel utilizzata., La concentrazione è misurata in peso di agarosio rispetto al volume di tampone utilizzato (g/ml). Per un’elettroforesi standard del gel dell’agarosio, un gel 0.8% dà la buona separazione o risoluzione dei grandi frammenti del DNA 5–10kb, mentre il gel 2% dà la buona risoluzione per i piccoli frammenti 0.2–1kb. 1% gel viene spesso utilizzato per un’elettroforesi standard. I gel ad alta percentuale sono spesso fragili e potrebbero non essere impostati in modo uniforme, mentre i gel a bassa percentuale (0,1-0,2%) sono fragili e non facili da maneggiare. I gel di agarosio a basso punto di fusione (LMP) sono anche più fragili del normale gel di agarosio., L’agarosio a basso punto di fusione può essere utilizzato da solo o contemporaneamente all’agarosio standard per la separazione e l’isolamento del DNA. PFGE e FIGE sono spesso fatti con gel di agarosio ad alta percentuale.

Caricamento dei campionimodifica

Una volta che il gel è impostato, il pettine viene rimosso, lasciando pozzetti dove i campioni di DNA possono essere caricati. Il buffer di carico viene miscelato con il campione di DNA prima che la miscela venga caricata nei pozzetti. Il tampone di carico contiene un composto denso, che può essere glicerolo, saccarosio o Ficoll, che aumenta la densità del campione in modo che il campione di DNA possa affondare sul fondo del pozzo., Se il campione di DNA contiene etanolo residuo dopo la sua preparazione, può galleggiare fuori dal pozzo. Il buffer di carico include anche coloranti colorati come xilene cianolo e bromofenolo blu utilizzati per monitorare l’avanzamento dell’elettroforesi. I campioni di DNA vengono caricati usando una pipetta.

elettroforesiemodifica

L’elettroforesi su gel di agarosio è più comunemente eseguita orizzontalmente in una modalità sottomarina in cui il gel della lastra è completamente immerso nel buffer durante l’elettroforesi. È anche possibile, ma meno comune, eseguire l’elettroforesi verticalmente, così come orizzontalmente con il gel sollevato sulle gambe di agarosio usando un apparato appropriato. Il tampone utilizzato nel gel è lo stesso del tampone in esecuzione nel serbatoio di elettroforesi, motivo per cui l’elettroforesi nella modalità sottomarina è possibile con il gel di agarosio.,

Per una risoluzione ottimale del DNA di dimensioni superiori a 2 kb nell’elettroforesi su gel standard, si consiglia da 5 a 8 V/cm (la distanza in cm si riferisce alla distanza tra gli elettrodi, pertanto questa tensione raccomandata sarebbe da 5 a 8 moltiplicata per la distanza tra gli elettrodi in cm). La tensione può anche essere limitata dal fatto che riscalda il gel e può causare la fusione del gel se viene eseguito ad alta tensione per un periodo prolungato, specialmente se il gel utilizzato è il gel di agarosio LMP. Una tensione troppo alta può anche ridurre la risoluzione, oltre a causare strisce di banda per grandi molecole di DNA., Una tensione troppo bassa può portare all’allargamento della banda per piccoli frammenti di DNA a causa della dispersione e della diffusione.

Poiché il DNA non è visibile alla luce naturale, il progresso dell’elettroforesi viene monitorato utilizzando coloranti colorati. Xilene cianolo (colore azzurro) comigates grandi frammenti di DNA, mentre bromofenolo blu (blu scuro) comigates con i frammenti più piccoli. Coloranti meno comunemente usati includono Cresolo rosso e arancione G che migrano davanti a bromofenolo blu. Un marcatore di DNA è anche eseguito insieme per la stima del peso molecolare dei frammenti di DNA., Si noti tuttavia che la dimensione di un DNA circolare come i plasmidi non può essere misurata con precisione utilizzando marcatori standard a meno che non sia stata linearizzata da restriction digest, in alternativa può essere utilizzato un marker di DNA supercoiled.

Colorazione e visualizationEdit

Il DNA e l’RNA sono normalmente visualizzati mediante colorazione con bromuro di etidio, che intercala nelle scanalature principali del DNA e dei fluoresces sotto la luce UV., L’intercalazione dipende dalla concentrazione di DNA e quindi, una banda ad alta intensità indicherà una maggiore quantità di DNA rispetto a una banda di minore intensità. Il bromuro di etidio può essere aggiunto alla soluzione di agarosio prima che gel, o il gel di DNA può essere macchiato più tardi dopo l’elettroforesi. La rimozione del gel non è necessaria, ma può produrre immagini migliori. Altri metodi di colorazione sono disponibili; esempi sono SYBR verde, GelRed, blu di metilene, blu cresile brillante, blu del Nilo solfato, e cristallo viola., SYBR Green, GelRed e altri prodotti commerciali simili sono venduti come alternative più sicure al bromuro di etidio in quanto è stato dimostrato di essere mutageno nel test Ames, sebbene la cancerogenicità del bromuro di etidio non sia stata effettivamente stabilita. SYBR Green richiede l’uso di un transilluminatore a luce blu. DNA macchiato con cristallo viola può essere visto sotto la luce naturale senza l’uso di un transilluminatore UV che è un vantaggio, tuttavia non può produrre una banda forte.

Quando viene macchiato con bromuro di etidio, il gel viene visualizzato con un transilluminatore ultravioletto (UV)., La luce UV eccita gli elettroni all’interno dell’anello aromatico del bromuro di etidio, e una volta tornati allo stato fondamentale, la luce viene rilasciata, rendendo il DNA e il complesso di bromuro di etidio fluorescenti. I transilluminatori standard utilizzano lunghezze d’onda di 302/312 nm (UV-B), tuttavia l’esposizione del DNA alle radiazioni UV per soli 45 secondi può produrre danni al DNA e influenzare le procedure successive, ad esempio riducendo l’efficienza della trasformazione, la trascrizione in vitro e la PCR. L’esposizione del DNA alle radiazioni UV dovrebbe pertanto essere limitata., Utilizzando una lunghezza d’onda superiore di 365 nm (gamma UV-A) provoca meno danni al DNA, ma produce anche fluorescenza molto più debole con bromuro di etidio. Dove è possibile selezionare più lunghezze d’onda nel transilluminatore, la lunghezza d’onda più corta verrebbe utilizzata per catturare immagini, mentre la lunghezza d’onda più lunga dovrebbe essere utilizzata se è necessario lavorare sul gel per un periodo di tempo prolungato.

L’apparecchio transilluminatore può anche contenere dispositivi di acquisizione di immagini, come una fotocamera digitale o polaroid, che consentono di scattare o stampare un’immagine del gel.,

Per l’elettroforesi su gel delle proteine, le bande possono essere visualizzate con macchie di Coomassie o argento.

Procedure a valle

Le bande di DNA separate sono spesso utilizzate per ulteriori procedure e una banda di DNA può essere tagliata dal gel come una fetta, sciolta e purificata., Contaminanti tuttavia possono influenzare alcune procedure a valle come PCR, e basso punto di fusione agarosio può essere preferito in alcuni casi in quanto contiene meno dei solfati che possono influenzare alcune reazioni enzimatiche. I gel possono essere utilizzati anche per le tecniche di blotting.