Abstract
Il benzoato di sodio è un conservante alimentare che inibisce la crescita microbica. Sono stati studiati gli effetti del conservante benzoato di sodio sull’induzione del micronucleo, sulla rottura del cromosoma e sulla mutazione del gene della superossido dismutasi Ala40Thr nei linfociti. Concentrazioni di benzoato di sodio di 0,5, 1,0, 1,5 e 2,0 mg/mL sono state trattate nella linea cellulare dei linfociti per 24 e 48 ore, rispettivamente., Test del micronucleo, tecnica di coltura cromosomica standard, PCR e tecnica di sequenziamento automatizzato sono stati eseguiti per rilevare micronucleo, rottura cromosomica e mutazione genica. I risultati hanno mostrato che, a 24 e 48 ore. il tempo di incubazione, le concentrazioni di benzoato di sodio di 1,0, 1,5 e 2,0 mg / mL hanno aumentato la formazione di micronuclei rispetto al gruppo di controllo (). A 24 e 48 ore. tempo di incubazione, le concentrazioni di benzoato di sodio di 2,0 mg/mL hanno aumentato la rottura del cromosoma rispetto al gruppo di controllo (). Il benzoato di sodio non ha causato Ala40Thr (GCGACG) nel gene della superossido dismutasi., Il benzoato di sodio ha avuto la tossicità mutagena e citotossica nei linfociti causata dalla formazione del micronucleo e dalla rottura del cromosoma.
1. Introduzione
I conservanti sono le sostanze aggiunte al cibo per prevenire la decomposizione da crescita microbica o cambiamenti chimici indesiderati. Ci sono molti conservanti che sono comunemente usati nelle industrie alimentari tra cui il gruppo benzoato, che viene utilizzato come batteriostatico e fungistatico in alimenti acidi e bevande come aceto, bevande gassate, marmellate, succhi di frutta e condimenti. Il benzoato di sodio è comunemente usato nel cibo in tutto il mondo., Al giorno d’oggi il consumo di cibi e bevande coinvolge con questi conservanti, a causa di quasi prodotti anche alimenti freschi o secchi sono sempre aggiunti conservanti per prolungare la durata della vita. Food and Drug Administration (FDA) regola la quantità di additivi alimentari consentiti negli alimenti o altri beni per contribuire a garantire la sicurezza e ridurre la possibilità di consumo eccessivo. Per l’utilizzo di gruppo benzoato come benzoato di sodio e benzoato di potassio in prodotti lattiero-caseari come gelato, budino e yogurt, FDA consente l’utilizzo di benzoato di sodio a 300 mg/1 kg., Come risultato dell’assunzione a lungo termine, anche se è piccola quantità, i conservanti possono causare danni ai consumatori all’interno di alcune malattie e nel livello dei cromosomi. I seguenti effetti negativi dei conservanti alimentari sono nausea, vomito, diarrea, rinite, broncospasmo, emicrania, anafilassi e iperattività nei bambini .
Il test del micronucleo (MN) è il sistema di test per la rilevazione di sostanze chimiche che induce la formazione di micronuclei nel citoplasma delle cellule binucleate., Questi micronuclei possono provenire da frammenti cromosomici o cromosomi interi che non sono in grado di migrare con il resto dei cromosomi durante l’anafase della divisione cellulare . A causa della tossicità del benzoato di sodio per l’uomo, lo scopo di questo studio era quello di valutare i potenziali effetti genotossici del benzoato di sodio che era uno dei conservanti alimentari sui linfociti umani.
La superossido dismutasi extracellulare (EC-SOD) è un enzima che nell’uomo è codificato dal gene SOD3. Questo gene codifica un membro della famiglia della proteina della superossido dismutasi (SOD)., Le ZOLLE sono enzimi antiossidanti che catalizzano la dismutazione di due radicali superossido in perossido di idrogeno e ossigeno. Si pensa che il prodotto di questo gene protegga il cervello, i polmoni e altri tessuti dallo stress ossidativo. La proteina viene secreta nello spazio extracellulare e forma un omotetramero glicosilato che è ancorato alla matrice extracellulare (ECM) e alle superfici cellulari attraverso un’interazione con eparan solfato, proteoglicano e collagene., Una frazione della proteina viene scissa vicino al C-terminale prima della secrezione per generare tetrameri circolanti che non interagiscono con l’ECM .
Lo stress ossidativo è stato implicato nel danno pancreatico delle cellule β, nella resistenza all’insulina e nella funzione vascolare nei pazienti diabetici. La mutazione missense Ala40Thr (GCG ACG) del gene EC-SOD è associata alla resistenza all’insulina e alla suscettibilità al diabete di tipo 2 . La tossicità del benzoato di sodio coinvolto nel diabete di tipo 2 sulla mutazione EC-SOD è stata studiata in questo studio.
2., Materiali e metodi
Lo studio è stato condotto utilizzando la linea cellulare dei linfociti umani (ATCC PCS-800-013).
2.1. Studio degli effetti del benzoato di sodio sul test del micronucleo e sulla rottura del cromosoma
La linea cellulare dei linfociti umani (ATCC PCS-800-013) è stata coltivata in un mezzo RPMI contenente siero bovino fetale al 10%, antibiotici e fitoemagglutinina M. Le colture di linfociti umani sono state incubate in un incubatore di CO2 al 5% a 37°C. Le concentrazioni di benzoato di sodio erano 0,5, 1,0, 1,5 e 2.,0 mg / mL e i tempi di incubazione per il trattamento dei linfociti sono stati rispettivamente di 24 e 48 ore per il test del micronucleo e lo studio cromosomico in questo studio. Per il test del micronucleo, la preparazione dei micronuclei è stata eseguita secondo le procedure di Fenech e Palus et al. . Per lo studio cromosomico, è stata eseguita una coltura linfocitaria umana standard per lo studio cromosomico e i cromosomi sono stati colorati con Giemsa . Micronuclei e rottura cromosomica sono stati osservati al microscopio.
2.2., Studio dell’effetto della tossicità del benzoato di sodio sulla mutazione del gene della superossido dismutasi Ala40Thr nei linfociti
I linfociti sono stati trattati con una concentrazione di benzoato di sodio di 2,0 mg/mL per 48 ore. Successivamente, il DNA è stato estratto dai linfociti trattati con kit di estrazione del DNA seguito da PCR e sequenziamento automatico del DNA.
2.3. Analisi statistica
Le correlazioni tra le formazioni di micronuclei, le concentrazioni di benzoato di sodio e i tempi di incubazione sono stati testati da ANOVA a livello.
3. Risultati e discussione
3.1., Studio degli effetti del benzoato di sodio sul test del micronucleo e sulla rottura del cromosoma
Per la formazione del micronucleo, i risultati hanno mostrato che le cellule micronucleate aumentavano quando la concentrazione di benzoato di sodio aumentava. Ai tempi di incubazione di 24 e 48 ore, le concentrazioni di benzoato di sodio di 1,0, 1,5 e 2,0 mg/mL hanno aumentato significativamente le cellule micronucleate rispetto al gruppo di controllo (), ma la concentrazione di benzoato di sodio di 0,5 mg/mL non ha aumentato significativamente le cellule micronucleate rispetto al gruppo di controllo () (Tabella 1 e Figura 1)., Micronucleated cells in each sodium benzoate concentration were shown in Figure 2.
Per il cromosoma rottura, a 24 e 48 ore di tempo di incubazione, il benzoato di sodio concentrazione di 2,0 mg/mL causato sorella separazione tra cromatidi fratelli e gap nei cromosomi quando confrontato con il gruppo di controllo (), ma il benzoato di sodio concentrazioni di 0.5, 1.0 e 1.5 mg/mL non ha causato la sorella di separazione tra cromatidi fratelli e gap nei cromosomi quando confrontato con il gruppo di controllo () (Figure 3 e 4). La separazione cromatidica sorella e il gap nei cromosomi sono stati mostrati in Figura 5.,
3.2. Studio dell’effetto della tossicità del benzoato di sodio sulla mutazione del gene Ala40Thr superossido dismutasi nei linfociti
La mutazione missense Ala40Thr del gene superossido dismutasi nei linfociti non è stata trovata in questo studio. Pertanto, la tossicità del benzoato di sodio non è stata coinvolta in questa mutazione e nell’insorgenza del diabete di tipo 2.,
Il benzoato di sodio è un conservante. Come additivo alimentare, il benzoato di sodio ha il numero E E211. È batteriostatico e fungistatico in condizioni acide. Il meccanismo inizia con l’assorbimento di acido benzoico nella cellula. Se il pH intracellulare scende a 5 o inferiore, la fermentazione anaerobica del glucosio attraverso la fosfofruttochinasi diminuisce bruscamente che inibisce la crescita e la sopravvivenza dei microrganismi che causano il deterioramento del cibo.
Ishidate et al. ha riferito che il benzoato di sodio ha causato aberrazioni cromosomiche nella linea cellulare del fibroblasto del criceto cinese., In uno studio in vitro, l’ornitina transcarbamilasi e la tirosina aminotransferasi, enzimi marcatori nei mitocondri e nel citosol degli epatociti del fegato di ratto, sono stati chiaramente soppressi dal benzoato di sodio a concentrazioni superiori a 500 µg/mL e hanno inibito la sintesi del DNA con 100 µg/mL. Oyanagi et al. e Mpountoukas et al. ha studiato in vitro il potenziale genotossico, citostatico e citotossico del benzoato di sodio nelle cellule del sangue periferico umano. Hanno riportato concentrazioni di benzoato di sodio di 2,0, 0,2 e 0,02 mm non hanno causato alcuna attività citostatica rilevata e 4 e 8 mm hanno causato una debole citostaticità., Hanno concluso che i conservanti possono essere nongenotossici a basse concentrazioni. TürkoǧLu e Zengin et al. ha studiato gli effetti del benzoato del sodio di 20-100 ppm per 5, 10 e 20 ore sulle punte della radice di Allium cepa. Rispetto al controllo, i valori dell’indice mitotico sono diminuiti e le aberrazioni cromosomiche (ponti anafase, mitosi C, micronuclei, ritardo, viscosità, rotture e distribuzione disuguale) sono aumentate con l’aumentare delle concentrazioni e con il periodo di trattamento più lungo., La tossicità del benzoato di sodio non ha causato la mutazione missense Ala40Thr del gene superossido dismutasi nei linfociti e non è stata associata all’insorgenza del diabete di tipo 2.
4. Conclusioni
Secondo il nostro studio, potrebbero essere le possibili ragioni del benzoato di sodio, danni al DNA colpiti., I risultati osservati in questo studio ottengono la conoscenza dei progressi per prevenire le malattie o diminuire i cambiamenti dei cromosomi umani causati dal consumo di additivi alimentari e insistono su una valutazione più ampia della sicurezza dei conservanti alimentari per attivare i dipartimenti governativi responsabili della salute pubblica per essere preoccupati per gli svantaggi degli additivi alimentari. Tuttavia, lo studio in vivo è necessario per raggiungere un’intera decisione sulla genotossicità conservante e sul meccanismo d’azione del benzoato di sodio sul danno al DNA nell’uomo.,
Conflitto di interessi
L’autore dichiara che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione del presente documento.
Riconoscimento
Questo lavoro è stato supportato da Thammasat University research grant, 2013.