Los detalles de un experimento de electroforesis en gel de agarosa pueden variar según los métodos, pero la mayoría siguen un procedimiento general.
Video que muestra el montaje de la plataforma de carga y/ejecución del gel.
fundición de gelEdit
carga de muestras de ADN en los pocillos de un gel de agarosa utilizando una pipeta multicanal.,
El gel se prepara disolviendo el polvo de agarosa en un tampón apropiado, como TAE o TBE, para ser utilizado en electroforesis. La agarosa se dispersa en el tampón antes de calentarla a punto de ebullición, pero evite hervir. Se permite que la agarosa fundida se enfríe lo suficiente antes de verter la solución en un molde, ya que el molde puede deformarse o agrietarse si la solución de agarosa está demasiado caliente. Se coloca un peine en el molde para crear pozos para cargar la muestra, y el gel debe estar completamente establecido antes de su uso.
la concentración de gel afecta la resolución de la separación del ADN., El gel de agarosa se compone de poros microscópicos a través de los cuales viajan las moléculas, y hay una relación inversa entre el tamaño del poro del gel de agarosa y la concentración – el tamaño del poro disminuye a medida que aumenta la densidad de las fibras de agarosa. La alta concentración de gel mejora la separación de moléculas de ADN más pequeñas, mientras que la reducción de la concentración de gel permite separar moléculas de ADN grandes. El proceso permite separar fragmentos que van desde 50 pares de bases hasta varias mega bases dependiendo de la concentración de gel utilizada., La concentración se mide en peso de agarosa sobre el volumen de tampón utilizado (g / ml). Para una electroforesis estándar del gel de la agarosa, un gel del 0.8% da la buena separación o la resolución de los fragmentos grandes de la DNA 5–10kb, mientras que el gel del 2% da la buena resolución para los fragmentos pequeños de 0.2–1KB. Los geles del 1% se utilizan a menudo para una electroforesis estándar. Los geles de alto porcentaje a menudo son frágiles y pueden no fijarse de manera uniforme, mientras que los geles de bajo porcentaje (0.1-0.2%) son frágiles y no son fáciles de manejar. Los geles de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) también son más frágiles que el gel de agarosa normal., La agarosa de bajo punto de fusión puede utilizarse sola o simultáneamente con la agarosa estándar para la separación y el aislamiento del ADN. PFGE y FIGE se hacen a menudo con geles de agarosa de alto porcentaje.
carga de las sampleseditar
Una vez que el gel se ha fijado, se retira el peine, dejando pocillos donde se pueden cargar las muestras de ADN. El tampón de carga se mezcla con la muestra de ADN antes de que la mezcla se cargue en los pozos. El tampón de carga contiene un compuesto denso, que puede ser glicerol, sacarosa o Ficoll, que aumenta la densidad de la muestra para que la muestra de ADN pueda hundirse en el fondo del pozo., Si la muestra de ADN contiene etanol residual después de su preparación, puede flotar fuera del pozo. El tampón de carga también incluye tintes coloreados como el cianol de xileno y el azul de bromofenol utilizados para monitorear el progreso de la electroforesis. Las muestras de ADN se cargan con una pipeta.
ElectrophoresisEdit
losa de gel de agarosa en el tanque de electroforesis con bandas de colorantes que indican el progreso de la electroforesis. El ADN se mueve hacia el ánodo.,
la electroforesis en gel de agarosa se realiza más comúnmente horizontalmente en un modo submarino en el que el gel de la losa está completamente sumergido en búfer durante la electroforesis. También es posible, pero menos común, realizar la electroforesis vertical, así como horizontalmente con el gel levantado sobre patas de agarosa utilizando un aparato apropiado. El búfer utilizado en el gel es el mismo que el búfer de funcionamiento en el tanque de electroforesis, por lo que la electroforesis en el modo submarino es posible con gel de agarosa.,
para una resolución óptima de ADN superior a 2 kb en tamaño en electroforesis de gel estándar, se recomienda 5 a 8 V/cm (la distancia en cm se refiere a la distancia entre electrodos, por lo tanto, este voltaje recomendado sería de 5 a 8 multiplicado por la distancia entre los electrodos en cm). El voltaje también puede estar limitado por el hecho de que calienta el gel y puede hacer que el gel se derrita si se ejecuta a alto voltaje durante un período prolongado, especialmente si el gel utilizado es gel de agarosa LMP. Un voltaje demasiado alto también puede reducir la resolución, así como causar rayas de banda para moléculas de ADN grandes., Un voltaje demasiado bajo puede conducir al ensanchamiento de la banda para pequeños fragmentos de ADN debido a la dispersión y difusión.
dado que el ADN no es visible a la luz natural, el progreso de la electroforesis se monitorea utilizando tintes de colores. El xileno cianol (color azul claro) comigra grandes fragmentos de ADN, mientras que el azul bromofenol (azul oscuro) comigra con los fragmentos más pequeños. Los tintes menos comúnmente utilizados incluyen Cresol Rojo Y Naranja G que migran por delante del azul de bromofenol. Un marcador de ADN también se ejecuta juntos para la estimación del peso molecular de los fragmentos de ADN., Tenga en cuenta, sin embargo, que el tamaño de un ADN circular como los plásmidos no se puede medir con precisión utilizando marcadores estándar a menos que haya sido linealizado por digestión de restricción, alternativamente, un marcador de ADN superenrollado puede ser utilizado.
tinción y visualizacióneditar
el gel con iluminación UV: El ADN teñido con bromuro de etidio aparece como bandas naranjas brillantes.
El ADN y el ARN se visualizan normalmente mediante tinción con bromuro de etidio, que se intercala en las ranuras principales del ADN y se fluorece bajo luz UV., La intercalación depende de la concentración de ADN y, por lo tanto, una banda con alta intensidad indicará una mayor cantidad de ADN en comparación con una banda de menor intensidad. El bromuro de etidio se puede agregar a la solución de agarosa antes de que se gelifique, o el gel de ADN se puede teñir más tarde después de la electroforesis. La decoloración del gel no es necesaria, pero puede producir mejores imágenes. Otros métodos de tinción están disponibles; ejemplos son el verde SYBR, GelRed, azul de metileno, azul de cresilo brillante, sulfato de azul del Nilo y violeta cristalino., SYBR Green, GelRed y otros productos comerciales similares SE VENDEN COMO alternativas más seguras al bromuro de etidio, ya que se ha demostrado que es mutagénico en la prueba de Ames, aunque en realidad no se ha establecido la carcinogenicidad del bromuro de etidio. SYBR Green requiere el uso de un transiluminador de luz azul. El ADN teñido con violeta cristalino se puede ver bajo luz natural sin el uso de un transiluminador UV, lo que es una ventaja, sin embargo, puede no producir una banda fuerte.
Cuando se tiñe con bromuro de etidio, el gel se observa con un transiluminador ultravioleta (UV)., La luz UV excita los electrones dentro del anillo aromático del bromuro de etidio, y una vez que regresan al estado fundamental, se libera luz, haciendo que el complejo de bromuro de ADN y etidio sea fluorescente. Los transiluminadores estándar usan longitudes de onda de 302/312-nm (UV-B), sin embargo, la exposición del ADN a la radiación UV durante tan solo 45 segundos puede producir daño al ADN y afectar los procedimientos posteriores, por ejemplo, reduciendo la eficiencia de la transformación, la transcripción in vitro y la PCR. Por lo tanto, debe limitarse la exposición del ADN a la radiación UV., El uso de una longitud de onda más alta de 365 nm (rango UV-A) causa menos daño al ADN, pero también produce una fluorescencia mucho más débil con bromuro de etidio. Cuando se pueden seleccionar múltiples longitudes de onda en el transilumintor, la longitud de onda más corta se utilizará para capturar imágenes, mientras que la longitud de onda más larga se debe usar si es necesario trabajar en el gel durante un período prolongado de tiempo.
el aparato transiluminador también puede contener dispositivos de captura de imágenes, como una cámara digital o polaroid, que permitan tomar o imprimir una imagen del gel.,
para la electroforesis en gel de proteínas, las bandas pueden visualizarse con tinciones Coomassie o silver.
Cortar en gel de agarosa de los sectores. Se debe usar equipo de protección cuando se usa transiluminador UV.
procedimientos Descendenteseditar
las bandas de ADN separadas se utilizan a menudo para procedimientos posteriores, y una banda de ADN puede ser cortada del gel como una rebanada, disuelta y purificada., Sin embargo, los contaminantes pueden afectar algunos procedimientos posteriores, como la PCR, y la agarosa de bajo punto de fusión puede preferirse en algunos casos, ya que contiene menos sulfatos que pueden afectar algunas reacciones enzimáticas. Los geles también se pueden usar para técnicas de secamiento.