detaliile unui experiment de electroforeză în gel de agaroză pot varia în funcție de metode, dar majoritatea urmează o procedură generală.
Video care arată ansamblul de platformă și de încărcare/de funcționare de gel.
Turnare de gelEdit
Încărcare mostre de ADN în puțuri de un gel de agaroză, folosind un sistem multi-canal pipeta.,gelul este preparat prin dizolvarea pulberii de agaroză într-un tampon adecvat, cum ar fi TAE sau TBE, pentru a fi utilizat în electroforeză. Agaroza este dispersată în tampon înainte de ao încălzi până la punctul de fierbere aproape, dar evitați fierberea. Agaroza topită este lăsată să se răcească suficient înainte de a turna soluția într-o turnare, deoarece turnarea se poate deforma sau crăpa dacă soluția de agaroză este prea fierbinte. Un pieptene este plasat în turnat pentru a crea puțuri pentru încărcarea probei, iar gelul trebuie setat complet înainte de utilizare.concentrația de gel afectează rezoluția separării ADN-ului., Gelul de agaroză este compus din pori microscopici prin care moleculele călătoresc și există o relație inversă între dimensiunea porilor gelului de agaroză și concentrația – dimensiunea porilor scade odată cu creșterea densității fibrelor de agaroză. Concentrația ridicată a gelului îmbunătățește separarea moleculelor de ADN mai mici, în timp ce scăderea concentrației gelului permite separarea moleculelor mari de ADN. Procesul permite separarea fragmentelor de la 50 de perechi de baze la mai multe baze mega în funcție de concentrația gelului utilizat., Concentrația se măsoară în greutate de agaroză față de volumul de tampon utilizat (g / ml). Pentru o electroforeză standard în gel de agaroză, un gel de 0,8% oferă o bună separare sau rezoluție a fragmentelor mari de ADN de 5–10KB, în timp ce gelul de 2% oferă o rezoluție bună pentru fragmentele mici de 0,2–1kb. 1% geluri sunt adesea folosite pentru o electroforeză standard. Gelurile cu procent ridicat sunt adesea fragile și pot să nu se fixeze uniform, în timp ce gelurile cu procent scăzut (0,1-0,2%) sunt fragile și nu sunt ușor de manevrat. Gelurile de agaroză cu punct de topire scăzut (LMP) sunt, de asemenea, mai fragile decât gelul normal de agaroză., Agaroza cu punct de topire scăzut poate fi utilizată singură sau simultan cu agaroza standard pentru separarea și izolarea ADN-ului. PFGE și FIGE sunt adesea realizate cu geluri de agaroză cu procent ridicat.
încărcarea eșantioneloredit
odată ce gelul a fost setat, pieptenele este îndepărtat, lăsând puțuri în care probele de ADN pot fi încărcate. Tamponul de încărcare este amestecat cu proba de ADN înainte ca amestecul să fie încărcat în puțuri. Tamponul de încărcare conține un compus dens, care poate fi glicerol, zaharoză sau Ficol, care ridică densitatea probei, astfel încât proba de ADN se poate scufunda în fundul puțului., Dacă proba de ADN conține etanol rezidual după preparare, acesta poate pluti din puț. Tamponul de încărcare include, de asemenea, coloranți colorați, cum ar fi xilen cianol și bromofenol albastru, utilizați pentru a monitoriza progresul electroforezei. Probele ADN sunt încărcate cu ajutorul unei pipete.
ElectrophoresisEdit
gel de Agaroză lespede în electroforeză rezervor cu benzi de coloranți indicând progresul electroforeză. ADN-ul se îndreaptă spre anod.,electroforeza în gel de agaroză se realizează cel mai frecvent pe orizontală într-un mod submarin, prin care gelul plăcii este complet scufundat în tampon în timpul electroforezei. De asemenea, este posibil, dar mai puțin obișnuit, să se efectueze electroforeza pe verticală, precum și pe orizontală cu gelul ridicat pe picioarele de agaroză folosind un aparat adecvat. Tamponul utilizat în gel este același cu tamponul de funcționare din rezervorul de electroforeză, motiv pentru care electroforeza în modul submarin este posibilă cu gel de agaroză.,pentru o rezoluție optimă a ADN-ului cu o dimensiune mai mare de 2 kb în electroforeza standard în gel, se recomandă 5 până la 8 V/cm (distanța în cm se referă la distanța dintre electrozi, prin urmare această tensiune recomandată ar fi de 5 până la 8 înmulțită cu distanța dintre electrozi în cm). Tensiunea poate fi, de asemenea, limitată de faptul că încălzește gelul și poate provoca topirea gelului dacă este rulat la tensiune înaltă pentru o perioadă prelungită, mai ales dacă gelul utilizat este gel de agaroză LMP. O tensiune prea mare poate, de asemenea, să reducă rezoluția, precum și să provoace dungi de bandă pentru moleculele mari de ADN., O tensiune prea mică poate duce la lărgirea benzii pentru fragmente mici de ADN datorită dispersiei și difuziei.deoarece ADN-ul nu este vizibil în lumina naturală, progresul electroforezei este monitorizat folosind coloranți colorați. Xylene cyanol (culoare albastru) comigrates mari fragmente de ADN, în timp ce albastru de Bromfenol (albastru inchis) comigrates cu fragmente mai mici. Coloranți mai puțin frecvent utilizate includ Cresol roșu și portocaliu G care migrează înainte de bromofenol albastru. Un marker de ADN este, de asemenea, rulat împreună pentru estimarea greutății moleculare a fragmentelor de ADN., Totuși, rețineți că dimensiunea de o circulară de ADN ca plasmidele nu poate fi precis determinată folosind standard de markeri excepția cazului în care a fost liniarizat de restricție digest, alternativ, un supercoiled ADN marker poate fi folosit.
Colorare și visualizationEdit
gel cu UV iluminare: ADN colorate cu bromură de etidiu apare ca o strălucire portocalie benzi.
ADN-ul, precum și ARN-ul sunt vizualizate în mod normal prin colorarea cu bromură de etidiu, care intercalează în canelurile majore ale ADN-ului și fluorescente sub lumină UV., Intercalarea depinde de concentrația ADN-ului și, astfel, o bandă cu intensitate ridicată va indica o cantitate mai mare de ADN comparativ cu o bandă de intensitate mai mică. Bromura de etidiu poate fi adăugată la soluția de agaroză înainte de a se gelifica sau gelul ADN poate fi colorat mai târziu după electroforeză. Decolorarea gelului nu este necesară, dar poate produce imagini mai bune. Alte metode de colorare sunt disponibile; exemple sunt verde SYBR, GelRed, albastru de metilen, albastru cresil strălucitor, sulfat Albastru De Nil și violet de cristal., SYBR Green, GelRed și alte comerciale similare de produse sunt vândute ca alternative mai sigure la bromură de etidiu ca s-a dovedit a fi mutagen în testul Ames, deși carcinogenitate de bromură de etidiu nu a fost stabilit. SYBR Green necesită utilizarea unui transiluminator cu lumină albastră. ADN-ul colorat cu cristal violet poate fi vizualizat în lumină naturală fără utilizarea unui transiluminator UV, ceea ce reprezintă un avantaj, cu toate acestea este posibil să nu producă o bandă puternică.când este colorat cu bromură de etidiu, gelul este văzut cu un transiluminator ultraviolet (UV)., Lumina UV excită electronii din inelul aromatic al bromurii de etidiu și, odată ce revin la starea de bază, lumina este eliberată, făcând fluorescența complexă a ADN-ului și bromurii de etidiu. Standard transilluminators folosesc lungimi de undă de 302/312-nm (UV-B), cu toate acestea, expunerea de ADN la radiații UV pentru cât de puțin 45 de secunde poate produce deteriorarea ADN-ului și afectează procedurile ulterioare, de exemplu reducerea eficienței de transformare, in vitro, transcriere, și PCR. Prin urmare, expunerea ADN-ului la radiațiile UV ar trebui limitată., Utilizarea unei lungimi de undă mai mari de 365 nm (gama UV-A) provoacă mai puține daune ADN-ului, dar produce și fluorescență mult mai slabă cu bromura de etidiu. În cazul în care mai multe lungimi de undă pot fi selectate în transillumintor, lungimea de undă mai scurtă ar fi utilizată pentru a capta imagini, în timp ce lungimea de undă mai lungă ar trebui utilizată dacă este necesar să se lucreze pe gel pentru orice perioadă lungă de timp.aparatul transiluminator poate conține, de asemenea, dispozitive de captare a imaginii, cum ar fi o cameră digitală sau polaroid, care permit realizarea sau imprimarea unei imagini a gelului.,pentru electroforeza în gel a proteinelor, benzile pot fi vizualizate cu Coomassie sau pete argintii.
tăierea feliilor de gel de agaroză. Echipamentul de protecție trebuie purtat atunci când se utilizează transiluminator UV.
Downstream proceduresEdit
benzile ADN separate sunt adesea folosite pentru proceduri suplimentare, iar o bandă ADN poate fi tăiată din gel ca o felie, dizolvată și purificată., Cu toate acestea, contaminanții pot afecta unele proceduri în aval, cum ar fi PCR, iar agaroza cu punct de topire scăzut poate fi preferată în unele cazuri, deoarece conține mai puțini sulfați care pot afecta unele reacții enzimatice. Gelurile pot fi, de asemenea, utilizate pentru tehnici de blotting.