00:00:05.18 In the first lecture I tried to articulate for you
00:00: 08.02 why protein phosphorylation is so fundamental for biology.o que eu gostaria de fazer aqui é aprofundar mais na estrutura e função da proteína cinase.se olharmos para o PKA, o PKA é, mais uma vez, um protótipo de kinase que entendemos melhor.
00: 00: 28.18 e é ativado por ligação hormonal neurotransmissor ao exterior de uma célula
00:00:37.00 neste caso adrenalina. Sempre…a adrenalina funciona como a glucagina.
00: 00: 40.,25E cada vez que segrega adrenalina na sua corrente sanguínea está a activar o PKA e a ligar-se a um receptor acoplado à proteína G.
00: 00: 48.11 você está passando por uma subunidade g alfa e você está se conectando a adenylate cyclase,
00: 00: 53.08 que leva à geração de AMP cíclico.
00: 00: 56.12 e neste caso, PKA, novamente, está dormente e é ativado quando
00:01:03.22 AMP cíclico se liga às subunidades regulatórias e então você libera a atividade catalítica.
00: 01: 09.02 e há muitos substratos.então vou focar aqui na subunidade catalítica., Como é que isso funciona como catalisador?e da próxima vez vamos falar sobre como ele é mantido neste estado dormente pelas subunidades regulamentares e como ele é direcionado para sites específicos por proteínas de andaimes.
00: 01: 25.25 mas, hoje eu quero focar no kinase.se voltarmos a esta história da kinase, começamos a encontrar…
00:01:35.17 há muitas cinases proteicas e isso veio da clonagem de muitas proteínas diferentes.
00: 01: 41.25 assim você poderia obter rapidamente a sequência.
00: 01: 43.,24Instead of doing this sequence the hard way, by chemically doing that sequence.
00: 01: 49.15 e assim a primeira sequência de proteína cinase foi PKA. Foi resolvido por Tatoni em 1981.
00: 02: 00.11 and it served then as a template, as a framework.
= = ligações externas = = ..Eu disse-te que o Src foi clonado em 1979, mas só quando o PKA foi sequenciado às 00:02:11: 03 é que a Margaret Dayhoff percebeu que o Src estava relacionado com o PKA. As duas sequências estavam relacionadas.
00: 02: 18.12 então foi isso que os colocou na mesma árvore aqui.
00: 02: 21.02 e depois em 1991, fizemos a primeira estrutura de uma proteína cinase.
00: 02: 25.,10e que nos permitiu ver as características tridimensionais desta família enzimática.
00: 02: 32.07 então, deixe-me dizer-lhe o tipo de informação que recolhemos de cada uma dessas descobertas.aqui está o kinome. O kinome é baseado apenas na análise de sequência.
00: 02: 46.03 And most genomes now have about 2% of their genome is coding for protein kinases.
00:02:54.11 e as plantas são os vencedores. Eles têm 4%. Eles têm mais proteínas cinases.
00: 02: 59.04 então é uma das maiores famílias de genes em todos os organismos eucarióticos.se olharmos para a sequência., O que nos diz a sequência?
= = ligações externas = = ..esta é uma descrição química da sua molécula.
00: 03: 15.10 você pode ver como a partir dessa sequência,
00: 03: 18.00 nós poderíamos então imediatamente saber que o Src clonado é um homolog de PKA.
00: 03: 23.11 e então poderíamos fazer coisas químicas; modificação com um ATP analógico, aqui modificada lisina 72.
00: 03: 31.08 que nos disse que esta lisina estava perto do local ativo, perto do local de ligação ATP.
00: 03: 36.06 And it also…mais tarde, mostrámos que podia ser às 00:03:40.,25cross-ligá-lo a dois resíduos diferentes de ácido carboxílico, resíduos ácidos.
00: 03: 47.07 de modo que todos os três resíduos, que estão muito separados na sequência linear,
00:03:52.00 deve estar perto e perto do local ativo da proteína dobrada.
00: 03: 57.07 e, em seguida, a outra parte da informação aqui é o site de fosforilação,
00:04:02.01 que é essencial para a atividade e que foi associado com este treonina particular.
00: 04: 10.02 então esses são os pequenos pedaços de informação que tínhamos.
00: 04: 12.09 você poderia tomar esses dois cinases,
00: 04: 16.,02 once you knew that Src and PKA were related and other kinases became Clone.
00: 04: 20.04 a descoberta inicial foi de Margaret Dayhoff que Src e PKA estavam relacionados
00:04:25.10 e tinha muitos resíduos conservados.
00:04:28.02 and then Tony Hunter…Hanks and Hunter did an analysis of the subdomains
00: 04: 35.13 and elucidated these various subdomains, each having a specific motif.
00: 04: 39.09 e esses subdomínios têm realmente aguentado com o tempo como a definição do núcleo de proteína cinase.
00: 04: 47.20 mas então quando tivemos a estrutura, Agora você poderia começar a entender
00: 04: 52.,15 como estes motivos se dobram para formar uma cinase activa.
00: 04: 57.09 então agora você pode começar a mapear essa sequência
00: 05: 03.22 de forma mais abrangente em uma estrutura estrutural.
00: 05: 07.18 então aqui mostramos os dois principais domínios que são conservados na família kinase.
00: 05: 12.17 um, o lobo pequeno, é principalmente associado com a ligação ATP.
00: 05: 16.12 the large one has a lot of residues associated with peptide binding and catalysis.estes são os resíduos conservados e podem ver-se espalhados por todo o núcleo da quinase.
00: 05: 27.,Também tem este local de fosforilação aqui. Isto é essencial para a sua actividade.
00: 05: 33.01 And another phosphorylation site out here at the C-terminus, outside the core.este é o n-lóbulo e este é o C-lóbulo.
00: 05: 41.26 OK, então agora podemos ter uma compreensão mais profunda desses motivos.
00: 05: 48.09 e isso é o que sabemos agora é o núcleo conservado que é compartilhado por todas essas proteínas naquela árvore cinoma.
00: 05: 56.25 todos eles têm este elemento comum para eles.
00: 06: 02.09 OK, então se olharmos diferentes exemplos,
00: 06: 05.,27I mostrou-lhe PKA, eu já falei sobre Src aqui em baixo com seus domínios SH3 e SH2.
00: 06: 13.15 estes são apenas alguns outros cinases. E você pode ver PKA é na verdade um pouco incomum
00: 06: 19.06 em que tem um relativamente small…it tem pouco caudas em cada extremidade, mas é principalmente
00: 06: 26.04 o domínio kinase E sua parte regulatória é uma subunidade separada — a subunidade regulatória.
00:06:33.00 enquanto outros cinases têm domínios fundidos: C1 E C2 ligados a PKC.
00:06:37.21 eles se ligam ao cálcio e ao diacil glicerol.
00: 06: 41.,01cíclico GMP proteína cinase, muito semelhante ao PKA, só que os domínios de ligação cíclicos GMP são fundidos ao núcleo cinase.
00: 06: 48.12 então há todos eles têm em comum o núcleo cinase, mas cada um tem essas variações.
00: 06: 54.18 então agora, novamente, se você voltar para o núcleo,
00:06:58.23 você pode realmente mapear esses subdomínios para o núcleo kinase.por isso vou mostrar-vos, mais uma vez, como estas se relacionam com o n-lóbulo e o C-lóbulo.
00: 07: 10.20 e dizer – lhe um pouco mais sobre os dois lóbulos também.
00: 07: 13.,14Here é agora a sequência de PKA onde podemos mapear a estrutura secundária;
00:07:20.00 uma hélice versus uma cadeia beta. Você pode mapeá-lo para esses subdomínios e ter um contexto tridimensional para esses subdomínios.aqui estão os subdomínios mapeados no núcleo do PKA e codificados por cores novamente.
00: 07: 38.14 assim você pode ver os subdomínios que compõem cada um destes lobos, todo o núcleo conservado.
00: 07: 47.06 e, eu vou levá-lo através destes muito rapidamente
00:07:50,09 apenas para mostrar-lhe algumas informações sobre estes.
00: 07: 54.25 So, this is the first on., Subdomínio I é o que chamamos de loop rico em gylcine.
00: 08: 00.03 e aqui você pode ver o loop rico em gylcine aqui.
00: 08: 03.21 você pode ver as 3 gylcines que são conservadas na maioria das cinases no topo.
00: 08: 08.21 e os recursos que você pode começar a resolver quais são os recursos que este motivo faz.
00: 08: 15.01 and then that’s followed by subdomain II.
00:08:18.10 Here’s that lisine, that K. That’s the lisine that gets modified by ATP analog.
00: 08: 24.02 este é o C-helix. Este é apenas o elemento helicoidal que está no lóbulo pequeno.e depois tens outra linha beta.,
00: 08: 37.07 e então você tem este subdomínio V que realmente liga os dois domínios.esta linha beta está no n-lóbulo e esta hélice está no C-lóbulo.
00: 08: 49,25 e esta pequena peça que os une é o linker que une os dois lóbulos.
00: 08: 55.09 e, em seguida, a e-helix. Esta é uma hélice muito hidrofóbica.
00: 09: 00.01 e o laço catalítico.
00: 09: 02.11 isto vai ser essencial para a catálise. É uma pequena folha beta que está no lóbulo C.
00: 09: 09.04 And this is another part of that beta sheet. Este é o ciclo de ativação.
00: 09: 15.,Por isso vou falar sobre isto em mais detalhes.
00: 09: 18.03 este é o f-helix — muito, muito importante. Esta molécula inteira está organizada em torno desta hélice-F.
00: 09: 25.05 é incomum, pois passa pelo meio do lóbulo C.
00: 09: 29.20 é muito hidrofóbico. Ao analisá-lo, seria de pensar que era uma hélice de membrana.
00:09:35.04 extremamente hidrofóbico.
00: 09: 37.14 e então este G-helix serve como local de acoplamento para proteínas e H-helix.
00: 09: 42.10 e aqui apenas para mostrar um exemplo comparando os subdomínios de PKA e Src,
00: 09: 48.,10 você pode ver que há poucas diferenças, mas no geral, esses sub-domínios são conservados.
00: 09: 53.10 a dobra é conservada em todas essas cinases proteicas, todas essas 500.então, eu vou contar a vocês sobre esses lobos primeiro porque eu acho que isso vai dar a vocês uma compreensão de como esses subdomínios trabalham juntos para criar uma cinase ativa.
00: 10: 10.00 e assim este é o n-lóbulo e ele contém este loop rico em glicina
00: 10: 15.02 que eu lhe falei. São as três glicinas.
00: 10: 17.,16e, em seguida, A C-helix é a outra característica realmente conservada aqui.
00: 10: 22.09 e você pode ver a lisina 72 e Glu91.
00: 10: 26.03 estes são os resíduos que foram ligados entre si por nossos estudos químicos.
00: 10: 30.14 então quando vimos pela primeira vez esta estrutura, minha primeira coisa foi dizer,
00: 10: 34.07 ” Onde está aquela lisina? E onde estão os resíduos que se cruzam com ele?”
00: 10: 37.19 e foi…estavam bem um ao lado do outro, tal como pensávamos dos estudos químicos.mas não conseguíamos entender como eles se relacionavam um com o outro até vermos aquela estrutura.,
00: 10: 49.04 OK, então o laço glicina é a parte mais móvel da cinase.
00: 10: 58.18 e tem que abrir e fechar.e quando fecha, encaixa-se no topo do fosfato gama de ATP e posiciona-o para ser transferido para um substrato de proteína.
00: 11: 11.08 então esta abertura e fechamento do laço glicina é essencial para a catálise.
00: 11: 16.01 And that hydrogen bond there between the glycine loop and The gamma phosphate of ATP is critical.
00: 11: 26.22 agora vamos para o lóbulo grande.
00: 11: 28.,17a maior parte é helicoidal, mas tem uma folha beta que está na fenda do local activo.
00: 11: 33.20 e alguns desses resíduos conservados estão aqui nestes dois loops
00:11:39.18 e estes são muito essenciais para a transferência do fosfato.
00: 11: 42.29 e isso fica em cima deste subdomínio helicoidal muito estável.
00: 11: 48.03 o n-lóbulo é muito maleável. Este lobo é muito, muito estável.
00:11:53.00 E algumas características-chave que o fosfato que é importante para a ativação da quinase
00:11:59.16 está aqui, e quando você phosphorylate site, o site ativo é maximamente ativo.,sem o fosfato não está activo.
00: 12: 12.09 por isso, embora esteja a 20 angstroms do local activo, é essencial criar a cinase activa.
00: 12: 18.15 e sem essa fosforilação, a enzima realmente se desenrola muito facilmente
00:12:23.16 e suas propriedades químicas são silenciosas diferentes.
00:12: 27.02 um fosfato, apenas um fosfato.
00: 12: 30.02 este é o laço catalítico. Muitos dos resíduos catalíticos que são importantes.este ciclo p+1 é importante a partir dos substratos peptídicos acoplados.
00: 12: 40.,11So, se olharmos para um mímico do que pensamos ser um estado de transição para a transferência do fosfato,
00:12:47.06 este é o…o fluoreto de alumínio serve como um mímico para o fosfato gama de ATP0:12:54.19 e você tem os resíduos do lacete catalítico no lóbulo C,
00:12:58.17 os resíduos do ciclo rico em glicina no lóbulo N.
00:13:01.15 convergem no fosfato gama e transferem-no para o substrato peptídico.
00:13:06.17 então, química muito bonita de como estes se reúnem no local ativo.
00: 13: 12.05 então vamos apenas olhar, por um momento, para catálise.,
00: 13: 15.03 So, the kinase must open and close as part of its catalytic cycle.
00: 13: 20.19 assim, quando está aberto, é na verdade silencioso maleável.
00: 13: 24.28 então, liga ATP e seus substratos peptídicos e aqui, por esse momento transitório de catálise,
00:13:32.05 está em uma conformação fechada.
00:13:34.08 Assim, se olharmos para a forma como estes olham na molécula, esta é a conformação à esquerda
00:13:44.20 onde você tem um buraco lá, que é onde a ATP vai caber em que grande buraco.
00: 13: 48.,19e, em seguida, a conformação fechada, você pode ver como esse site ativo fenda realmente vem para baixo e fecha.
00: 13: 55.09 e agora, neste…isto só vai dar uma imagem de como esta kinase abre e fecha.
00: 14: 01.19 and it’s morphing the open and closed states.
00: 14: 03.24 e eu vou apenas apontar, antes de vermos o filme, A lisina 72 e o Glu91.
00: 14: 09.22 estes foram dois dos resíduos que cruzaram.
00: 14: 11.24 então agora você pode ter uma noção de como abertura e fechamento do local ativo fenda está ocorrendo.
00: 14: 21.,Então isto é apenas uma morfação — a conformação aberta e a conformação fechada,
00:14:25.25 essencialmente a respiração de uma molécula de proteína cinase.
00: 14: 30.21 OK, então se olharmos de perto agora para aquela conformação fechada onde ATP Está ligado,
00: 14: 37.06 você pode ver a maior parte do ATP está enterrado naquele buraco profundo ali.
00: 14: 40.22 and just the little gamma phosphate is sticking out at the edge of the interface
00: 14: 46.12 between the glycine rich loop from the n-lobe and the catalytic loop from the large lobe.
00: 14: 53.00 e então você pode ver aqui como um peptídeo se encaixa nesse local.,
00:14:57.01 so, it docks mainly o large lobe.
00:15: 00.27 aqui está o resíduo p+1. É um bom, neste caso, bolso hidrofóbico onde os resíduos hidrofóbicos atracam.
00: 15: 07.29 este é um pseudo-substrato. É uma alanina em vez de uma serina.se fosse uma serina, aceitaria o fosfato e transferiria o fosfato.
00: 15: 16.08 e então, PKA gosta de resíduos básicos e assim você tem resíduos ácidos na proteína em vermelho
00:15:23.06 que reconhecem esses aminoácidos básicos no péptido.
00: 15: 26.,Em seguida, para o peptídeo inibidor que se liga…este é um peptídeo de ligação de afinidade muito elevada.
00: 15: 35.17 ele tem uma hélice que acende para o local ativo fenda e isso serve como um local de amarração.por isso já te disse como funciona o PKA. É a kinase que entendemos melhor em termos de estrutura e função.
= = ligações externas = =
00: 15: 55.22 e, o que podemos aprender agora com uma grande família?
00:16:02.15 nós temos…como estas são tão importantes para doenças, temos muitas estruturas cinase.
00: 16: 07.,17quinases tornaram-se um alvo importante para a descoberta de drogas. Então temos muitos cinases.
00: 16: 12.22 então eu mostrei a vocês o que podemos aprender com a análise de profundidade de uma quinase.
00: 16: 18.13 o que podemos aprender com este kinome estrutural agora onde você tem
00:16:22.26 não só muitas sequências, mas você tem muitas estruturas?
00: 16: 26.16 e, podemos aprender diferentes tipos de coisas.
00: 16: 28.28 vou contar algumas lições globais que podemos aprender sobre toda a família.
00: 16: 32.10 pode-se mergulhar profundamente em uma única família
00:16:35.,05E descubra quais são as características únicas de uma subfamília contra outra.
00: 16: 39.27 então este é apenas seis das diferentes estruturas cinase, núcleos cinase.
00: 16: 47.25 e você pode ver que os subdomínios são principalmente conservados em todos estes cinases.o que podemos aprender com esse kinome estrutural?
00: 16: 59.04 uma das coisas que fizemos foi desenvolver um método que chamamos de alinhamento de padrões espaciais locais.
00: 17: 07.01 And this is just rapidly comparing any two structures and looking at the spatially similar residues.
00: 17: 15.09 e isto fornece – lhe um padrão.,
00: 17: 18.05 você pode fazer isso independente de qualquer alinhamento de seqüências.
00:17: 20.25 apenas duas estruturas, compare-as.
00: 17: 23.07 e você tem figuras como esta que mostram a relação espacial de resíduos em duas cinases proteicas.
00: 17: 34.00 e assim se olharmos aqui você pode ver um par de resíduos chave
00:17:38.09 que estas arestas indicam uma ligação espacial entre dois aminoácidos.
00: 17: 46.23 And the more edges that go to a particular amino acid, the higher its involvement score.
00:17:52.15 nós chamamos isso de uma pontuação de envolvimento.
00: 17: 54.,24So fazemos uma rede de resíduos espaciais relacionados em duas cinases proteicas.
00: 18: 01.24 And this is called the involvement score. Quanto maior a pontuação de envolvimento,
00: 18: 05.15 os aminoácidos mais relacionados com o espaço interagem com esse aminoácido em particular.
00: 18: 12.24 então usamos isto primeiro para comparar cinases ativas e inativas.o que é diferente?
00: 18: 21.06 você pode encontrar diferenças espacialmente relacionadas que são únicas para
00:18:28.01 a cinase ativa e que não estão lá na cinase inativa?
00: 18: 31.06 e a partir desta análise definimos o que chamamos de coluna vertebral.,
00:18:38.06 Temos, posteriormente, denominou-a de regulamentar coluna
00:18:42.00 É hidrofóbico coluna vertebral que é espacialmente conservada em todos os quinase
00:18:47.12 e é interrompida quando o quinase está inativo.
00: 18: 50.22 e é feito de resíduos hidrofóbicos.
00:18:53.02 eles vêm de resíduos não contíguos. Então um está vindo de beta-4, Um é de alfa-C,
00: 18: 59.16 um é do motivo DFG, um é do motivo HRD, dois estão no n-lobo, dois estão no C-lobo.
00: 19: 08.14 e eles se alinham para fazer esta coluna hidrofóbica.
00: 19: 12.,00You nunca iria encontrar isso por comparações de seqüências porque, pela análise de seqüência, eles são não-contíguos
00: 19: 17.26 mas eles são espacialmente bem definidos como um motivo conservado.
00: 19: 25.20 então nós voltamos e olhamos para todos os cinases
00: 19: 29.00 e descobrimos que havia na verdade dois espinhos.então encontramos uma segunda coluna vertebral, que chamamos de coluna catalítica, além da coluna regulatória.
00: 19: 40.22 And the importance of…mais uma vez, são resíduos hidrofóbicos que são tanto do n-lóbulo quanto do C-lóbulo.
00: 19: 48.,04A coisa única sobre a coluna catalítica é que é o anel de adenina de ATP que
00:19:52.19 completa a coluna e liga os dois.isso significa que uma vez que você adicione ATP, você agora tem uma nova coordenação entre o n-lóbulo e o C-lóbulo.
00: 20: 04.02 então a outra característica que veio desta análise é esta f-helix.
00: 20: 08.09 This a very hydrophobic helix that spans the C lobe.isto é muito incomum para uma proteína globular como uma cinase.
00: 20: 17.02 mas, é muito conservado e serve como o framework…
00: 20: 22.,Está ligado à coluna regulatória e à coluna catalítica. nucleates…it realmente fornece a arquitetura na qual você monta uma kinase ativa.
00: 20: 36.27 e nós chamamos isso de motivo S2H ou dois espinhos e uma hélice.
00: 20: 41.19 e essa é realmente a arquitetura fundamental que cada proteína cinase.então, aqui vou mostrar – vos aquela hélice.
00: 20: 49.12 você pode ver como ele passa pelo meio deste lóbulo C.
00: 20: 55.02 você nunca iria prever que isso era parte de uma proteína globular por análise de sequência.
00: 21: 01.,10e você pode ver, à medida que isto gira em torno, a relação dessa hélice F com o resto da proteína.
= = ligações externas = = ..tudo é nucleado à volta da hélice F.
00: 21: 16.25 você pode ver alguns dos resíduos chave que emergem
00: 21: 20.29 que serão importantes para a ligação aos dois espinhos que estão saindo daquela hélice F.
00:21:26.26 Lá você pode ver os dois espinhos,
00:21:28.04 como aqueles dois espinhos são realmente ancorados em uma maneira fundamental para o F hélice
00:21:33.10 e o ciclo catalítico. Todos os elementos funcionais estão realmente ligados a esta hélice F.,
00: 21: 44.12 assim, novamente, você pode ver aqui, quando você abre e fecha a kinase,
00: 21: 48.22 essas conformações…você pode ver que os dois espinhos permanecem intactos como parte desse movimento respiratório.não interfere com o movimento respiratório da cinase.
00: 22: 02.03 assim, Vou dar-lhe um exemplo aqui do…este é o receptor de insulina,
00: 22: 06.15 outro membro do ramo tirosina cinase.
00: 22: 11.03 e esta é a conformação ativa do receptor de insulina e você pode ver que
00:22:15.00 Os dois espinhos estão intactos., Esta é uma conformação totalmente activa do receptor de insulina kinase.
00: 22: 20.27 quando não está ativo (e é ativado pela fosforilação de seu laço de ativação aqui),
00: 22: 28.06 quando não está fosforilado em seu laço de ativação,
00: 22: 31.13 então você pode ver a coluna em quebrado.
00: 22: 33.25 e esta é uma maneira pela qual ele pode ser quebrado.
00: 22: 37.28 na verdade, um resíduo da coluna regulatória passa e enche o bolso de adenina
00: 22: 43.07 para a coluna catalítica.
00: 22: 44.10 mas há muitas, muitas variações de como você pode quebrar essa coluna vertebral.
00: 22: 49.,20So, porque é que o fosfato é tão importante?
00: 22: 53.00 eu falei sobre este fosfato ser realmente importante.é importante para o receptor de insulina. É importante para a PKA.
00: 23: 02.04 que fosfato no ciclo de ativação…
00:23:04.22 E eu vou mostrar a vocês: Aqui está um fosfato em PKA
00:23:08.22 e fazer sete diferentes ou eletrostática ou ligação de hidrogênio medicamentosas
00:23:17.10 com diferentes cadeia lateral de resíduos.
00: 23: 20.09 e é um local de fosforilação por integração.
00: 23: 24.,19 ele vai para este histidina que está na hélice C, no subdomínio 3.
00:23:30.10 ele vai para a lisina 189, que na verdade está em beta-strand 9.
00:23:37.26 ele vai para arginine 165 que logo antes do laço catalítico.
00: 23: 44.26 e integra todo este ciclo de ativação.portanto, está a desempenhar um papel crítico na integração de todos os subdomínios da proteína.nesta última parte eu queria voltar para os cinases e a doença e novamente, relacionar-me com o que eu lhe disse sobre esses subdomínios e as espinhas.
00: 24: 08.,25There são, provavelmente, mais agora, mas pelo menos 30% de cinases são implicados em várias doenças
00:24:13.28 e que está apenas crescendo o tempo todo como nós mergulhar mais profundamente em diferentes cinases.
00: 24: 20.08 muitos mais são propensos a seguir como nós obter mais e mais informações genômicas
00:24:24.21 e correlações de doenças.
00:24:28.10 Kinases são tractable como alvos de drogas porque você pode inibi-los e
00:24:34.00 eu vou mostrar que você pode exemplo disso.este é o kinome humano e estou a mostrar-lhe uma quinase no ramo da tirosina.
00: 24: 42.,Esta é a Abl, um parente da Src.
00: 24: 46.07 e nesta doença fatal leucemia mylógena crônica
00: 24: 51.23 é este Abl que é modificado. Fundiu-se a outra proteína e torna-a oncogene.
00: 24: 56.27 assim, é constitucionalmente ativo. Está sempre ligado.é isso que faz um oncogene … não se pode desligá-lo.
00:25:03.03 assim, este Gleevec foi descoberto como um inibidor muito específico do BCR-Abl.
00: 25: 12.07 e esta é a verdadeira prova de princípio que diz que os cinases são alvos de drogas muito tratáveis.
00: 25: 23.,07 se olharmos para Abl com ATP ligado a ele você pode ver aqui os dois espinhos;
00: 25: 28.09 a coluna regulamentar, a coluna catalítica. Esta é a ABL activa.
00: 25: 32.16 e então você compara isso agora com a estrutura onde Gleevec Está ligado
00: 25: 37.17 e isso foi feito pelo laboratório de John Kuriyan.
00: 25: 42.04 ele está ligado à fenda do local ativo, mas você pode ver quando Gleevec se liga,
00: 25: 46.22 a coluna regulamentar é quebrado e por isso ele está realmente tecendo através de
00:25:52.07 tanto a coluna catalítica e a coluna regulamentar.
00: 25: 57.10 assim que se liga a uma conformação inativa
00: 25: 59.,12E podeis ver precisamente as características que estão a ser aproveitadas por Gleevec.
00: 26: 05.03 So, one of the sites that is frequently associated with resistance to Gleevec
00: 26: 11.20 is a mutation of this threonine residue in the ATP binding pocket here.
00: 26: 17.10 então esta treonina é por vezes referida como o guardião.
00: 26: 20.04 And I think in the previous slide…aqui está o resíduo de guardião.eu mostro-lhe Onde está o resíduo do guardião.é uma treonina. E assim a mutação que acontece muitas vezes é que ela é convertida em metionina.,
00:26:33.10 so threonina is a small residue. A metionina é um resíduo muito mais volumoso.é tão volumoso que impedirá Gleevec de se ligar.
00: 26: 41.15 é um obstáculo estérico por isso bloqueia isso.
00:26:43.19 Mas, não mais do que isso e esse recente estudo Daley e Kuriyan mostra que
00:26:51.07 quando você tem a metionina lá, em vez de treonina,
00:26:55.08 a metionina é um bom resíduo hidrofóbico e preenche uma lacuna entre
00:27:01.22 catalisador e regulamentar a coluna vertebral e o que ela faz é agora cria um muito estável, coluna ativa.
00: 27: 08.,06só alterando esse resíduo, a treonina, para uma isoleucina (metionina),
00:27:13.17 você não só abolir a ligação de Gleevec, você também criar um oncogene.você agora estabilizou esta coluna regulatória de uma forma que já não requer fosforilação.
00: 27: 26.01 assim que esta não é apenas resistente ao Glevec, esta proteína é um oncogene.
00: 27: 35.06 então, eu falei sobre os subdomínios e como eles são conservados na família
00:27:39.26 e eu dei – lhe uma apreciação de como os kinases funcionam
00:27:42.,24 por isso que eles são difíceis de ser tratados de destino para a descoberta de drogas
00:27:46.18 e, em seguida, o que eu quero falar sobre a próxima vez que é a forma como o cinases regular
00:27:51.23 e realmente fazer o que nós não vamos ser tão interessado na catalítica de máquinas,
00:27:56.01 vamos estar realmente interessado nas superfícies da quinase
00:27:59.18 e como PKA, em especial, ligam a outras proteínas.
00: 28: 04.04