um projecto de medidas repetidas é aquele em que são feitas medições múltiplas ou repetidas em cada unidade experimental. A unidade experimental pode ser uma pessoa ou um animal, e medições repetidas podem ser feitas em série no tempo, como em pressões sistólicas semanais ou pesos mensais. As avaliações repetidas podem ser medidas em diferentes condições experimentais. Medições repetidas na mesma unidade experimental também podem ser feitas em um ponto no tempo., Por exemplo, pode ser interessante medir o diâmetro de cada uma das várias lesões dentro de cada pessoa ou animal em um estudo. A dependência, ou correlação, entre as respostas medidas no mesmo indivíduo é a característica definidora de um projeto de medidas repetidas. Esta correlação requer uma análise estatística que explique adequadamente a dependência entre as medições dentro da mesma unidade experimental, o que resulta numa análise estatística mais precisa e poderosa.,

Análise de medidas repetidas abrange um espectro de aplicações, que no caso mais simples é uma generalização do teste t emparelhado.1 um projeto de medidas repetidas dentro dos sujeitos pode ser considerado como uma extensão do teste t emparelhado que envolve ≥3 avaliações na mesma unidade experimental. A análise de medidas repetidas também pode lidar com projetos mais complexos e de ordem superior com componentes internos e componentes multifaccionais entre indivíduos. O foco aqui é em projetos internos.,

questões de Projecto

um projecto completamente aleatório é aquele em que cada unidade experimental (eg, pessoa ou animal) é atribuída aleatoriamente a 1 de vários tratamentos concorrentes. Por exemplo, um estudo é proposto para comparar 4 tratamentos (por exemplo, um controlo e 3 tratamentos activos distintos ou um controlo e 3 doses diferentes do mesmo tratamento), e uma amostra de 20 animais são aleatorizados para os 4 tratamentos., A aleatorização pode ser implementada por 1 de uma série de técnicas possíveis que vão desde uma simples aleatorização (em que uma única sequência dos números 1 a 4 é produzida, e os animais são atribuídos de acordo com a sequência) a uma aleatorização mais envolvida que usa estratificação ou blocos permutados.2 a estratégia dos blocos permutados é utilizada para assegurar o equilíbrio no processo de aleatorização, de modo a que seja atribuído um número igual de animais a cada tratamento., Esta estratégia pode ser projetada para garantir o equilíbrio em determinados pontos de inscrição, por exemplo, equilíbrio entre os 4 tratamentos após a aleatorização de 8 (2 por tratamento) ou 12 (3 por tratamento) unidades experimentais. Esta estratégia é geralmente usada quando a inscrição em um estudo ocorre ao longo do tempo. Com a estratégia dos blocos permutados, 5 animais seriam distribuídos aleatoriamente a cada tratamento no presente exemplo.

O objetivo da análise é comparar as respostas entre os 4 tratamentos. Se a variável dependente ou de resultado for contínua, este ensaio é realizado com ANOVA.,3 Se a variável resultado for categórica, este ensaio é realizado com um ensaio χ2.4 estes ensaios baseiam-se no pressuposto de que as medições dentro e entre tratamentos são independentes ou não relacionadas. Se as unidades experimentais não estiverem relacionadas (ou seja, não são membros da família ou ninhada), e se uma medição tiver sido feita por unidade, então esta hipótese é razoável.em contrapartida, num projecto de medidas repetidas, são efectuadas medições múltiplas em cada unidade experimental. Considere novamente a aplicação descrita acima, na qual o objetivo da análise é comparar os 4 tratamentos concorrentes., Um projecto de medidas repetidas poderia envolver 5 animais, cada um medido 4 vezes, uma vez em cada condição experimental. A concepção das medidas repetidas envolve um número menor de animais, o que é simultaneamente eficiente e eticamente apelativo.se forem medidos 5 animais em cada uma de 4 condições experimentais diferentes, estará novamente disponível um total de 20 medições para análise. As 20 medições, no entanto, não são independentes, mas estão relacionadas dentro dos sujeitos., Dado que as medições podem ser afectadas por características internas (por exemplo, idade ou factores genéticos), são necessários testes estatísticos que tenham devidamente em conta a correlação interna. Se assumirmos que as medições feitas no mesmo indivíduo estão correlacionadas, o teste para uma diferença nos tratamentos envolverá uma variação menor residual ou de erro do que aquela baseada em um projeto completamente randomizado, aumentando assim a precisão na análise.,

um projeto de bloco randomizado é aquele em que um conjunto de unidades experimentais são organizadas em grupos homogêneos ou blocos com base em uma característica assumida para afetar o resultado. O objetivo é ter R réplicas de cada um dos tratamentos k em cada um dos blocos b, com o tamanho total da amostra n=kbr. Considere novamente o estudo comparando 4 tratamentos concorrentes (k=4). Suponha que o resultado do interesse é conhecido para ser afetado pela idade. Com n = 20 unidades experimentais independentes, estas podem ser organizadas em 5 grupos etários (por exemplo, quintis de idade) com 1 replicação por grupo (k=4, b=5, r=1)., Em um projeto de bloco randomizado, unidades experimentais dentro de cada bloco são aleatoriamente atribuídas a tratamentos, e esta técnica reduz a variação devido a diferenças de idade. O projeto pode ser pensado como replicações de uma experiência completamente aleatória em que há tantas replicações quanto blocos.

alguns projetos de medidas repetidas podem ser vistos como um caso especial do projeto de bloco aleatório em que o bloco é a unidade experimental individual (por exemplo, pessoa ou animal). O projeto de bloco aleatório é muitas vezes usado com irmãos ou companheiros., A unidade familiar é o bloco, e avaliações são repetidas em cada membro da família. As avaliações dentro de uma família ou ninhada estão relacionadas. A contabilização das dependências dentro do bloco resulta em um teste mais preciso das diferenças de tratamento.a análise de medidas repetidas pode ser utilizada para avaliar as alterações ao longo do tempo num resultado medido serialmente ou para testar diferenças em 1 ou mais tratamentos com base em avaliações repetidas nos mesmos indivíduos., A aplicação mais simples tem 1 factor dentro dos indivíduos (por exemplo, cada um dos indivíduos n é medido sob k tratamentos experimentais distintos), e o objectivo da análise é testar uma diferença nos tratamentos experimentais. Isto é conseguido através da construção de uma estatística de teste como a razão da variância devido aos tratamentos para a variância residual ou de erro. Na análise de medidas repetidas, a variância total pode ser dividida em variância entre indivíduos e variância dentro dos indivíduos. A variação entre indivíduos reflecte diferenças individuais de indivíduos., A variância dentro dos indivíduos consiste em 2 componentes, diferenças entre os tratamentos e erro ou variação residual. A estatística de ensaio para testar a hipótese nula de igualdade de meios é a razão entre a variação devida aos tratamentos e a variação residual, após a remoção da variação entre sujeitos. Os Componentes da variância e a estatística do ensaio são ilustrados na Figura 1. Os detalhes dos cálculos são ilustrados no exemplo 1.

exemplo 1

um estudo em animais é realizado para avaliar a activação do transgene no coração. O resultado primário é o encurtamento por cento fraccional, que é medido na linha de base e novamente após 2, 4 e 6 semanas de tratamento. Uma avaliação final é feita após 6 semanas de tratamento e 2 semanas de tratamento. No início, os ratinhos tinham 12 semanas de idade; assim, nas avaliações subsequentes, tinham 14, 16, 18 e 20 semanas de idade., Três ratos completaram o protocolo, e os dados sobre o encurtamento fraccional por cento medidos em cada ponto de tempo são mostrados na Tabela 1. A hipótese de pesquisa é que a média dos escores de encurtamento por cento são diferentes ao longo do tempo. Os meios em cada ponto de tempo são mostrados na linha inferior da Tabela 1 e diminuem ao longo do tempo. Para testar uma diferença significativa de meios ao longo do tempo, utiliza-se uma ANOVA de medidas repetidas. Os resultados das medidas repetidas ANOVA constam do quadro 2. A estatística de ensaio para a igualdade de meios ao longo do tempo é F=95.,4 (df=4,8), que é altamente estatisticamente significante em p

0, 0001. Assim, uma diferença altamente estatisticamente significativa existe no encurtamento percentual médio ao longo do tempo.

Suponha que esses mesmos dados foram incorretamente analisados como se fossem derivados de um estudo randomizado de design. Os resultados da ANOVA, testando uma diferença de meios ao longo do tempo, estão contidos na Tabela 3. Se os dados são tratados incorretamente como 15 observações independentes e analisados com ANOVA, a estatística de F É F=45.1 (df=4,10), que ainda é altamente estatisticamente significante., Observe a diferença no erro ou variação residual entre os métodos. O denominador da estatística F para testar as diferenças de médias ao longo do tempo é o erro quadrado médio. Nas medidas repetidas ANOVA, o erro quadrado médio é de 6,1 em comparação com 12,9 no ANOVA que assumiu a independência. Neste exemplo específico, a análise incorrecta ainda produziu um resultado significativo. Em outras aplicações, a falta de contas das dependências entre as observações poderia resultar em uma descoberta não significativa., As medidas repetidas de ANOVA que contabilizam adequadamente as dependências nos dados produzem um teste mais preciso.

Se uma diferença significativa é encontrado, ele pode ser de interesse para testar diferenças entre os pares de tratamentos, ou, no exemplo 1, entre os pontos de tempo. Estes testes devem ser tratados com um procedimento de comparação múltipla que novamente lida adequadamente com a correlação nos dados e também controla a taxa de erro tipo I (ver Larson3 e Cabral5 para mais detalhes).,a ANOVA é a ANOVA de dois factores com medidas repetidas em 1 factor. Nesta aplicação, um grupo de tratamento (por exemplo, médicos versus tratamento cirúrgico, tratamento versus placebo, ou contestada versus incontestável) é frequentemente utilizado, e assuntos diferentes são atribuídos a cada grupo de tratamento, mas o resultado é novamente medido repetidamente ao longo do tempo. O objetivo é comparar os tratamentos com relação às diferenças no resultado., O factor de tratamento é um factor entre indivíduos e não tem medidas repetidas. No entanto, são feitas repetidas avaliações sobre cada assunto em cada tratamento ao longo do tempo, pelo que o factor tempo deve ser adequadamente tratado na análise. O procedimento novamente divide a variação para produzir estatísticas F para testar as hipóteses de igualdade de resultados entre tratamentos e igualdade de resultados ao longo do tempo. A variância é particionada como mostrado na Figura 2, e os seguintes testes de hipótese são realizados. O primeiro teste é um teste para o efeito do tratamento., Isto é feito através da construção de uma estatística F como a razão entre a variação do tratamento e a variação de erro devida aos indivíduos dentro dos tratamentos (Figura 2). O segundo teste é para diferenças nos resultados ao longo do tempo, o fator repetido. Isto é novamente realizado através da construção de uma estatística F. A estatística de F para as diferenças ao longo do tempo é baseada na relação entre variação de tempo e erro ou variação residual., Como este é um projeto de dois fatores, uma possibilidade de uma interação entre o tratamento e fatores de tempo (ou seja, um efeito diferente do tratamento ao longo do tempo) também pode existir, e isso é testado construindo uma estatística F como a razão da variação tratamento-por-tempo para o erro ou variação residual (Figura 2). Alguns investigadores testam primeiro o tratamento e os efeitos no tempo e, em seguida, realizam um teste para a interação, enquanto outros primeiro testam para uma interação e, em seguida, testam para o tratamento e efeitos no tempo., Se estatisticamente significativa a interação existe, o efeito do tratamento é diferente ao longo do tempo, e, portanto, os testes para efeito de tratamento e, globalmente, um efeito de tempo não completamente explicar as diferenças no resultado (ver Kleinbaum et al6 para mais detalhes).

estes dados podem ser analisados de várias maneiras diferentes., Uma questão importante é a especificação adequada da natureza das correlações entre medições na mesma pessoa, chamada estrutura de covariância. A maioria dos pacotes de computação estatística oferece uma variedade de estruturas de covariância para estes tipos de análise, e as covariâncias devem ser modeladas corretamente. Três estruturas são muito populares e se encaixam em muitas aplicações. A primeira é chamada de simetria composta e assume que as correlações entre todos os pares de medidas são as mesmas., Isto pode ser razoável para um estudo de medidas repetidas em que cada indivíduo é medido em k condições experimentais diferentes. O segundo é chamado de “autoregressive da ordem 1”, ou AR(1), e assume que as correlações entre pares adjacentes são maiores do que as correlações entre pares mais distantes. Isto pode ser razoável para os dados medidos em série no tempo, em que as medidas mais proximais estão mais correlacionadas do que as medidas tomadas mais distantemente no tempo. Para esta estrutura, os pontos de tempo devem ser aproximadamente igualmente espaçados no tempo., Uma terceira estrutura popular é chamada de “não estruturada”, e como o nome indica, ela assume que cada par de medidas tem sua própria correlação. Embora este último possa parecer atraente, na verdade produz uma análise menos poderosa, porque os dados primeiro devem ser usados para avaliar a estrutura de correlação e, em seguida, para realizar as análises primárias. Alguns pacotes de computação estatística (eg, SAS, SAS Institute, Cary, NC) oferecem métricas para determinar qual estrutura melhor se adapta aos dados. Uma dessas medidas é o critério de informação Akaike, com o qual valores menores indicam um melhor ajuste., Tal como em todas as análises estatísticas, é importante planear e implementar modelos parsimónicos que sejam biologicamente sensatos. Um exemplo de uma ANOVA de dois factores com medidas repetidas em 1 factor está contido no exemplo 2.

Exemplo 2

um estudo aleatorizado, controlado por placebo, é efectuado para estimar os efeitos a curto prazo de um medicamento anti-hipertensor na pressão arterial sistólica. Os indivíduos são distribuídos aleatoriamente para receber o tratamento ou um placebo., A pressão arterial sistólica é medida antes da administração da primeira dose de tratamento (valor basal) e novamente às 2, 4 e 6 semanas após o início do tratamento (ou placebo). O estudo envolve 6 participantes, 3 dos quais são distribuídos aleatoriamente a cada braço de tratamento; os dados sobre a pressão arterial sistólica medida em cada ponto temporal são apresentados na Tabela 4. A hipótese de pesquisa é que a pressão arterial sistólica média é diferente entre os tratamentos.

A figura 3 mostra a média da pressão arterial sistólica ao longo do tempo para os participantes o tratamento dado um placebo. A pressão arterial sistólica média diminuiu ao longo do tempo em ambos os grupos, com uma diminuição mais acentuada no grupo de tratamento. Os resultados da ANOVA de dois factores com medidas repetidas constam do Quadro 5. A estatística de teste para a igualdade de tratamento significa que ao longo do tempo é F=36.,1 (df=1,4), que é altamente estatisticamente significante em P=0, 0039. Assim, existe uma diferença estatisticamente significativa na média das pressões sistólicas no sangue entre os doentes tratados com a medicação antihipertensiva e os que receberam placebo. O teste para uma diferença na pressão arterial sistólica média ao longo do tempo também é altamente estatisticamente significativo . O teste para a interacção entre o tratamento e o tempo é marginalmente significativo . Este teste avalia a homogeneidade da diferença na pressão arterial média entre os grupos de tratamento e placebo ao longo do tempo., A figura 3 mostra que a diferença de meios está a aumentar ao longo do tempo, o que está a conduzir o ensaio de interacção para se aproximar da significância estatística.

As análises apresentadas na Tabela 5 suponha igualdade de correlações entre as medidas (ou seja, composto de simetria). Uma análise alternativa para estes dados seria uma estrutura de correlação autoregressiva na qual as correlações entre medidas tomadas mais próximas no tempo são mais elevadas do que as medidas medidas mais distantes., Se assumirmos uma estrutura de covariância AR (1), a estatística de teste para a igualdade de tratamento significa que ao longo do tempo é F=12.7, o que é significativo em P=0.0235. O teste para uma diferença média de pressão arterial sistólica ao longo do tempo é altamente estatisticamente significativas (F=30.4, P=0,0001), e o teste para a interação entre tratamento e tempo é significativo (F=3.7, P=0.0423). O critério de informação Akaike é 102.7 para o modelo de simetria composta e 98.0 para o modelo AR(1). Como valores menores indicam melhor ajuste, o modelo AR(1) é uma melhor escolha para estes dados.,

estimativas do efeito do tratamento são fornecidas na Tabela 6 tanto para o modelo que assume simetria composta quanto para o modelo que assume uma estrutura de covariância AR(1). Note que as estimativas do efeito do tratamento são as mesmas; no entanto, os erros padrão são diferentes, o que afeta o significado da diferença.

Abordagens Alternativas para a Análise de Medidas Repetidas de Dados

Quando repetidas medidas foram tomadas, em cada unidade experimental, várias abordagens para a análise estatística são possíveis., Pensando novamente na ANOVA de dois fatores com medidas repetidas em 1 Fator, uma abordagem simples para lidar com a correlação entre medidas repetidas na mesma pessoa envolve o cálculo de pontuações médias para cada pessoa ao longo do tempo. In example 2, this would reduce the sample sizes to n1=3 and n2=3, and the test for treatment differences could be performed with the unpaired t test. Usando os dados no exemplo 2, isso produziria t=6, 0, P=0, 0039, o que indica que uma diferença significativa está presente na pressão arterial sistólica média entre os grupos., Este teste t baseia-se em apenas 3 observações por grupo e 1 observação por participante (a pressão arterial sistólica média ao longo do tempo). Esta abordagem é analiticamente correta, mas não tira o máximo proveito dos dados. Esta abordagem é muito menos poderosa do que a abordagem de medidas repetidas. Uma segunda alternativa é avaliar as diferenças de tratamento em cada momento. No exemplo 2, isto traduz-se na realização de 4 ensaios t não emparelhados, 1 em cada ponto de observação. Esta abordagem é mais uma vez ineficaz, porque não permite qualquer avaliação da tendência ao longo do tempo., Além disso, esta abordagem aumenta a probabilidade de um resultado falso-positivo devido a vários testes estatísticos.5,7 a abordagem mais eficiente é explicar explicitamente a dependência dos dados através do uso de técnicas de medidas repetidas, e isso pode ser feito de muitas maneiras diferentes.

pressupostos e detalhes analíticos

uma suposição importante na análise de medidas repetidas é a esfericidade, ou homogeneidade das variâncias ao longo do tempo. A maioria dos pacotes de computação estatística oferecem testes para a esférica., Se a suposição for violada, então modelos mistos podem ser usados para abordar explicitamente diferenças.8

um número de pacotes de computação estatística estão disponíveis que oferecem procedimentos para medidas repetidas ANOVA. Dentro destes pacotes, várias opções estão disponíveis para a realização dos testes. A SAS, por exemplo, oferece vários procedimentos que podem lidar com dados de medidas repetidas., Deve ser prestada especial atenção à disposição dos dados, à especificação dos factores (por exemplo, fixos ou repetidos), aos Termos de erro adequados para as estatísticas de ensaio e à natureza das correlações entre observações medidas no mesmo indivíduo (ou seja, a estrutura de covariância). Littell et al7, 8 fornecem uma abordagem detalhada para a utilização de SAS para a análise de medidas repetidas.

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