Funções da notocorda no desenvolvimento de vertebrados

Padronização

A notocorda tem vários papéis na padronização surroundingtissues. Uma vez que estas questões foram exaustivamente analisadas noutros locais(Cleaver e Krieg, 2001;Dodd et al., 1998; Hogan and Bautch, 2004; Holland et al., 2004), apenas menciono alguns dos principais papéis aqui. Talvez o melhor caracterizado seja o terole do notochord em modelar o tubo neural., Uma série de experimentsinvolving tanto o transplante e remoção da notocorda duringdevelopment mostrou que a notocorda pode ser um sinal de que a formação do floorplate, que é o ventral-a maioria destino da medula espinhal(Placzek et al., 1991;van Straaten et al., 1989;Yamada et al., 1991). Entre os sinais segregados pelo notochord estão as proteínas Hedgehog (Hh). O SonicHedgehog, em particular, induz uma gama de destinos ventrais da medula espinhal de forma agradada, ao mesmo tempo que suprime a expressão de genes dorsais característicos (Placzeket al., 1993; Yamada et al.,, 1993; Yamada et al.,1991). Reforçando e mantendo eventos de desenvolvimento anteriores, os sinais notochord também estão envolvidos no estabelecimento da assimetria LR; a ablação do notochord em Xenopus gastrulae resulta na aleatorização daasimetria (Danos e Yost,1995; Lohr et al.,1997). Em teleóstatos, sinais HH derivados de notochord controlam a formação do mioseptum horizontal, bem como especificar destinos de twitchmuscle lentos (Barresi et al., 2000; Devoto et al.,1996). Sinais derivados de Notochord são importantes para especificar a formação da aorta dorsal (Claver etal., 2000; Fekany et al.,, 1999; Isogai et al., 2003; Lawson et al.,2002), bem como para a especificação normal do campo cardíaco(Goldstein e Fishman, 1998).Finalmente, o notochord é importante para o desenvolvimento normal do earlyendoderm e do pâncreas (Cleaver andKrieg, 2001; Kim et al.,1997).

estrutural

embora os papéis de padrão do notóforo sejam essenciais para o desenvolvimento de invertebrados normais, o notóforo também tem um papel estrutural essencial.,O notochord é o principal elemento ósseo axial do embrião cordado precoce;sem um embriões notochord totalmente diferenciado não conseguem alongar (Odenthal et al., 1996; Saúde et al., 2000;Schulte-Merker et al., 1992;Schulte-Merker et al., 1994;Stemple et al., 1996;Talbot et al., 1995). Para muitas espécies, isso resulta na incapacidade de nadar corretamente, de escapar da predação e de se alimentar. Alguns conhecimentos desta função do notóforo foram obtidos a partir de estudos de mutações de peixes-Zebra (Driever et al., 1996; Haffter et al., 1996)., Um certo número de loci envolvidos na formação notocord foram identificados em ecrãs sistemáticos de grande escala para mutações que afectam a embriogénese dos peixes-Zebra(Fig. 3) (Odenthal et al., 1996; Stemple et al., 1996). Como eu discuti, alguns dos loci identificados nestas telas foram considerados importantes para a formação do cordamesoderm, papéis de sinalização de grande importância do notochord. A maior parte dos loci, contudo, foi considerada profundamente importante para os aspectos estruturais da função notocord.,para compreender a estrutura de notochord, é útil considerar a parte de notochorda de um sistema mecânico necessário para a locomoção(Fig. 4). Os embriões de peixes-zebra, por exemplo, são capazes de virar as caudas no prazo de um dia após a fertilização, e observar e nadar no prazo de 3 dias. Por analogia,o notochord é como uma mangueira de incêndio, possuindo uma bainha forte mas flexível que pode resistir a altas pressões hidrostáticas. Considere então uma situação em que a mangueira de incêndio está cheia de balões de água, cada um empurrando contra o outro e contra a bainha., Em suchan arranjo, a mangueira de incêndio seria alongada e rígida, mas capaz de dobrar qualquer direção. Finalmente, com os cabos a correr ao longo da parte superior e inferior da mangueira de incêndio, os cabos resistiriam a qualquer flexão para cima ou para baixo da mangueira, e qualquer força que actuasse na mangueira de incêndio iria desviá-la lateralmente.Para o embrião de peixe-zebra, o equivalente à mangueira de incêndio é a membrana basilar Peri-notocordal e os balões de água são as células vacuolatadas de não-tocord. Correndo ao longo do topo do notóforo é a placa do piso e por cima do fundo é o hipóforo., Consistente com este papel estrutural, tanto a placa do chão quanto o hipoclorpo expressam uma variedade de proteínas de cartilagem,tais como o colagénio tipo II (Yan et al.,1995). Além disso, mutações em genes como oep e ociclops (ndr2 – Zebrafish Information Network), que conduzem a uma perda substancial de placas de pavimento,também produzem embriões com uma curvatura probounddownward (Hatta, 1992; Hatta et al.,1991; Schier et al.,1997). Assim, embora ainda não esteja directamente estabelecido, é possível que a placa do piso e o hipoclorco actuem como cabos nos respectivos lados dorsal e ventral do notóforo.,

em peixe-zebra, a formação da membrana basilar peri-notocordal e do vacuol são afectados por duas classes fenotípicas de mutações. Uma classe,originalmente encontrada para afetar tanto o notochord quanto o desenvolvimento do cérebro, compreende thebashful, grumpy e sleepy loci. Estes loci foram recentemente encontrados para codificar o laminininin α1 (bashful), lamininß1 (grumpy) e laminin γ1 (sleepy), que se formam da membrana basilar(Parsons et al., 2002) (S. M. Pollard, PhD thesis, University College London, 2002)., A segunda classe de mutações foi originalmente encontrada para afetar notóforo e o desenvolvimento melanóforo de forma precoce na embriogénese, levando, eventualmente,a uma morte celular catastrófica através de embriões mutantes. Esta classe compreende atchim, feliz anddopey, que codificam, respectivamente, α, β e ychains do coatomer complexo, que é um componente importante da thesecretory caminho e é essencial para a sobrevivência de todas as células eucarióticas(Coutinho et al., 2004). Normalmente, considera-se que o complexo decoatómero desempenha uma função de apicultura eucariotica., É surpreendente que a perda da actividade dos coatomeres nos embriões de peixe-zebra conduza a um fenótipo notocórdio. Uma explicação é que o coatômero é fornecido maternalmente, e que a formação do notochord está entre os primeiros tecidos em que a demanda secreta excede a oferta materna. Esta perda de actividade secreta leva à perda da membrana do subsolo de notochord e a uma falha da formação de vacúolo. Juntos, a laminina de peixe-zebra e os coatomermutantes destacam a importância da estrutura notochord para sua função.,

as Lamininas e a estrutura notochord

As Lamininas são complexos de proteínas heterotriméricas obrigatórios que consistem em cadeia ana, β e γ, e são parte integrante das membranas basais.Membranas basais são estruturas onipresentes com papéis diversos, mas são habitualmente associadas a um epitélio. Normalmente, em uma membrana basal,laminina trímeros polimerizar para formar uma malha, que é uma referência cruzada para um typeIV colágeno malha por nidogens(Colognato e Yurchenco,2000; Iozzo, 1998;Timpl e Brown, 1996;Yurchenco e O’Rear, 1994).,Além disso, associado com membranas basais estão heparina-sulfateproteoglicanos (Iozzo, 1998).As membranas basais são importantes para a definição das fronteiras entre os tecidos, para a sinalização entre as células e, em algumas situações, para a criação de uma barreira mecânica forte (Timpl e Brown,1996). Este último papel é de particular importância no kidneyglomerulus, onde a membrana basilar serve como parte integrante do aparelho de filtração, ao mesmo tempo em que suporta altas pressões hidrostáticas(Miner E Li, 2000). Isto é semelhante ao papel que a membrana basilar peri-notocordal desempenha.,Fig. 3. fases de desenvolvimento notocord afectadas por mutações. A transição do organizador dorso para o choramesodermia é afectada por mutações em vários genes.At o topo da Cascata da especificação dorsal são as proteínas ichabod andß-catenina (Kelly et al.,2000). Na sua ausência, os tipos ventrais de mesoderme podem formar mas não a cordamesodermia. O bozozok e a cabeça flutuante loci eachencode homeodomain-contendo proteínas que são necessárias para a cordamesodermeificação., Na ausência completa de oep, tal como no mutante de zigótico-carnal (Mz), mesendoderm não é especificado, incluindo o thecordamesoderm. Os laminins (bashful, grumpy e sleepy),os coatomers (sneezy, happy and dopey), brachyury (notail) e um locus desconhecido, doc, são todos necessários para a diferenciação de propernotochord. As pontas de flecha indicam (A) a progenitora de cordamesodermia do escudo, (B) O cordamesodermia e (c) o acorde diferenciado.

Lamininas são diversas, provavelmente refletindo seus diversos papéis. Em humanos existem cinco genes codificadores α, quatro β e três γ De laminina.Através de várias combinações de cadeias α, β e γ, foram identificadas 12 isoformas de lamininas diferentes(Colognato e Yurchenco,2000). No peixe-zebra, até agora, a maioria dos genes da laminina pode ser encontrada em sequência genômica, embora apenas alguns tenham sido sequenciados em cDNA de comprimento assfull.,

a clonagem posicional dos peixes-Zebra bashful, grumpy andsleepy loci levou à identificação de três cadeias de lamininas;α1, β1 e γ1 (Parsons etal., 2002) (S. M. Pollard, PhD thesis,University College London, 2002). Os fenótipos mutantes de rabugento e sonolento são indistinguíveis, enquanto o fenótipo tímido é sempre mais fraco.,Durante o desenvolvimento do mal-humorado e sonolento mutante embriões,a notocorda fenótipo primeiro torna-se aparente quando vacúolos falhar formproperly e quando os genes que são caracteristicamente expressa bychordamesoderm, tais como a equidna ouriço, deixam de ser extinto, asthey durante normal notocorda diferenciação. Elétron microscopicanalysis peri-notochordal membrana basal mostra que é completelyabsent nestes mutantes, de anticorpos e de coloração mostra uma completa falta oflaminin 1 imunorreatividade em mais gravemente afectadas, mal-humorado andsleepy mutante embriões., Nos embriões mutantes mais fracos, a membrana Péri-notocordal do porão está faltando apenas nas regiões previamente afetadas do notochord. Na parte posterior destes embriões, o “thenotochord” é normalmente diferenciado e tem imunoreactividade laminina 1. As diferenças entre o tímido e o mal-humorado ou o adormecido devem-se a uma redundância entre as cadeias de laminina α. A interrupção da expressão laminina4 em embriões mutantes tímidos, que não possuem lamina1, conduz ao fenótipo notóforo grave observado em mutantes mal-humorados e doentes com esclerose múltipla ,e a uma perda total da imunoreactividade da laminina 1 (S. M., Pollard, PhD thesis, University College London, 2002).

estas quatro cadeias de lamininas-α1, α4, β1 e γ1– participam na formação da base peri-notocordalmembrane, e a cordamesoderma expressa mRNA para cada cadeia. Mas será que o Senhor só por si é responsável pelo lamininim na sua membrana de Cave? Esta questão foi abordada por um ensaio de enxerto do organizador. Nestes experimentos, um organizador dorsal de tipo selvagem foi enxertado na região ventral de um embrião mutantost, ou vice-versa, e os embriões geminados resultantes foram analisados para diferenciação morfológica notocódica., Surpreendentemente, para ambos os tecidos mutantes ensonados e sedentos, ambos os tipos de enxertos levaram ao mesmo resultado, um notochord normalmente diferenciado (Parsons et al., 2002). Uma análise da imunoreactividade da laminina mostrou que quando o organizador de tipo selvagem istransplantou em hospedeiros mutantes, as proteínas lamininas 1 rodeiam o acorde transplantado. Assim, as lamininas podem ser fornecidas por fontes extra notocordais ou pelo próprio notochord.Fig. 5. membrana basilar Peri-notocordal., A) a estrutura tri-laminar da membrana basalperi-notocordal (entre as pontas de flecha) mostrou a utilização de microscopia Electron, a partir da bainha de uma célula notocord de tipo selvagem. I, camada interna; m, camada medial; o, camada exterior. B) Esta estrutura é perturbada pela morte de uma célula de notocord mutante, onde faltam as camadas exteriores e médias. É provável que a camada interna seja constituída por laminina, uma vez que C)os níveis de imunoreactividade da laminina de tipo selvagem são claramente observados em D)embriões mutantes espirros, mas são abolidos em e) estimulantes do sono.,

existe alguma relação entre a diferenciação notocord e a presença da membrana basal. É provável que isso envolva sinalização da membrana basal para a cordamesodermia. O estado de diferenciação pode ser determinado pela análise da expressão genética. Por exemplo, echidnahedgehog, que é um homólogo de peixe-zebra do ouriço Indiano mamífero, é normalmente expresso em cordamesoderm, mas quando os diferenciais notocórdios e vacúolos inflam, a expressão de equidna hedgehog é extinta(Currie e Ingham, 1996)., No entanto, nos mutantes, echidna hedgehog é persistentemente expressado(Parsons et al., 2002). Bycontrast, quando mutante notocorda se desenvolve em um tipo selvagem de fundo, thenotochord diferencia normalmente, sugerindo que um sinal de que residam em thebasement membrana é recebido. Uma possibilidade é que o próprio laminino seja o irmão. Existem muitos receptores de laminina de superfície celular, mas a interrupção de vários destes receptores não consegue copiar o fenótipo de perda de função da laminina,embora outros fenótipos sejam aparentes., Outra possibilidade é que outro sinal residindo na membrana do subsolo serve como uma diferença notocord. A presença de proteoglicanos heparina-sulfato em membranas basais em geral, e especificamente nas membranas basais notochord, forneceria o contexto correto para uma variedade de proteínas do fator de crescimento solúvel. A natureza do sinal de diferenciação notocord, no entanto, continua por resolver.

estes estudos mostram que a formação de um membrane peri-notochordal basement é essencial não só para a estrutura do notochord, mas também para a diferenciação propernotochord., Na verdade, a perda de vários outros genes que não são componentes de membrana de base, por si só, mas que afetam a formação da membrana de cavidade Peri-notocordal, também afeta a diferenciação do acorde de raiz.

Coatomers e notocorda estrutura

Semelhante ao sono e mal-humorado, laminina mutantes,atchim, feliz e dunga mutantes são também phenotypicallyindistinguishable (Coutinho et al.,2004)., Nestes mutantes, o notochord não consegue diferenciar-se, medida tanto pela expressão persistente de genes marcadores iniciais, tais como o Hedgehog deechidna, como pela falha em formar vacuóis normalmente inflados. Tal como nos mutantes lamininos, a membrana da cave falha em termproperly. Ao contrário dos mutantes lamininos, no entanto, a partir de cerca de 48 horas após o espirro de fertilização, os mutantes felizes e dopados sofrem de uma morte celular generalizada por apoptose e os embriões desintegram-se. Por posicionamento, identificamos que espirros, felizes e dopé encodem as proteínas do peixe-zebra α, β e β’ coatomer(Coutinho et al.,, 2004).

sete subunidades de coatômero, em combinação com a pequena GTPase Arf1, compõem a camada de vesículas de COPI (Bannykh et al.,1998; Cosson e Letourneur, 1997; Lowe e Kreis,1998; Nickel e Wieland,1998). Nas células eucarióticas, existem pelo menos três sistemas de vesicularização. As vesículas revestidas de clatrina manipulam a endocitose e as copi-coatedvesicles mediam o transporte de carga secreta do endoplasmicreticulum para o Golgi., Pensa-se que as vesículas revestidas de COPI são amplamente responsáveis pelo transporte retrógrado de enzimas no Golgi que mantêm a sua polaridade, e pelas máquinas que transportam proteínas do Golgi de volta para o retículo endoplasmático rugoso (RER).

a análise microscópica Electrónica revelou duas características importantes das células notocordcells em mutantes de coatómero de peixe-zebra (Coutinho et al., 2004).Em primeiro lugar, a via secreta é bloqueada, resultando em acumulação massiva de materiais dentro da RER, e ruptura do aparelho de Golgi é evidente.,Em segundo lugar, a membrana Péri-notocordal do porão não se forma. Normalmente, a membrana basilar da membrana Peri-notocordal tem uma estrutura trilaminar (Fig. 5). A camada mais próxima da membrana plasmática é um único material corado escuro com aparentes ligações à membrana plasmática subjacente. Distal para essa camada é uma mediallayer de fibras orientadas em uma direção em torno da notocorda célula, anddistal esta é uma camada externa de fibras orientadas em um orthogonaldirection. No coatômero mutantes, as duas camadas exteriores não estão presentes, mas uma camada interna distinta é frequentemente observada., A coloração com o antibiótico lambodysuggests de que a camada interna em grande parte compreende a laminina. Utilizando enxertos de tecido mutante de organismos dorsais em embriões de tipo selvagem, e vice-versa, foi investigada a origem embriónica das duas camadas exteriores desta membrana subterrânea. Apesar de experiências de enxerto semelhantes com mutantes lamininas demonstrarem que a laminina pode ser fornecida quer pelo próprio notocorde quer por fontes extra-notocordais, enxertos de tecido mutante coatômero mostram que tanto o fenótipo da membrana terer e cave são autônomos ao notocorde., Assim, enquanto a camada interna rica em laminins pode ser fornecida pelos tecidos circundantes,as camadas externas da membrana basilar peri-notocordal são susceptíveis de ser cercadas pelas próprias células notocord.

O notochord tem duas características, uma membrana subterrânea espessa e um vacúolo,ambos os quais colocam uma demanda incomum na Via secreta. As proteinas de coatómero são essenciais para todas as células e as proteínas e os mRNAs de coatómero são suplementados quaternalmente. Durante o desenvolvimento de tipo selvagem, o mRNAs que coatomera proteínas são expressados em cordamesoderm a um nível elevado., De facto, quando observado pela situhybridização, a expressão do coatómero mRNA parece ser específica de cordamesoderm e tem um padrão temporal e espacial de expressão semelhante aos genes tais como FLH. O elevado nível de expressão do coatómero no desenvolvimento do modermodelo é susceptível de ser zigótico e, por conseguinte, fornece alguma explicação para a forma como as mutações num gene essencial das células podem conduzir a defeitos específicos de desenvolvimento Auricular.