os detalhes de uma experiência de electroforese em gel de agarose podem variar dependendo dos métodos, mas a maioria segue um procedimento geral.
Vídeo mostrando a montagem do equipamento e de carregamento/execução do gel.
Carcaça de gelEdit
Carregamento de amostras de DNA para os poços do gel de agarose, utilizando uma pipeta multicanal.,o gel é preparado dissolvendo o pó de agarose num tampão adequado, como TAE ou TBE, a utilizar na electroforese. A agarose é dispersa no tampão antes de aquecê-la até um ponto de ebulição próximo, mas evita a ebulição. Permite-se que a agarose fundida arrefeça suficientemente antes de verter a solução num molde, uma vez que o molde pode deformar ou rachar se a solução de agarose estiver demasiado quente. Coloca-se um pente no molde para criar poços para o carregamento da amostra, e o gel deve ser completamente ajustado antes da utilização.a concentração do gel afecta a resolução da separação do ADN., O gel de agarose é composto por por poros microscópicos através dos quais as moléculas viajam, e há uma relação inversa entre o tamanho DOS poros do gel de agarose e o tamanho DOS poros de concentração diminui à medida que a densidade das fibras de agarose aumenta. A alta concentração de gel melhora a separação de moléculas de DNA menores, enquanto a redução da concentração de gel permite que grandes moléculas de DNA sejam separadas. O processo permite separar fragmentos que vão de 50 Pares de bases a várias Mega bases, dependendo da concentração de gel utilizada., A concentração é medida em peso de agarose sobre o volume de tampão utilizado (g/ml). Para uma electroforese padrão em gel de agarose, um gel de 0, 8% dá uma boa separação ou resolução de grandes fragmentos de ADN de 5–10kb, enquanto o gel de 2% dá uma boa resolução para pequenos fragmentos de 0,2–1kb. 1% gels é frequentemente usado para uma electroforese normal. Os géis de alta percentagem são frequentemente frágeis e podem não ser fixados uniformemente, enquanto os géis de baixa percentagem (0,1-0,2%) são frágeis e difíceis de manusear. Os géis de agarose de baixo ponto de fusão (LMP) são também mais frágeis do que o gel de agarose normal., A agarose de ponto de fusão baixo pode ser utilizada isoladamente ou em simultâneo com a agarose padrão para a separação e isolamento do ADN. A PFGE e a Figo são frequentemente feitas com géis agarose de elevada percentagem.uma vez colocado o gel, o pente é removido, deixando poços onde amostras de DNA podem ser carregadas. Mistura-se o tampão de carregamento com a amostra de ADN antes de a mistura ser carregada para os alvéolos. O tampão de carga contém um composto denso, que pode ser glicerol, sacarose, ou Ficoll, que aumenta a densidade da amostra de modo que a amostra de DNA pode afundar para o fundo do poço., Se a amostra de ADN contiver etanol residual após a sua preparação, pode flutuar para fora do poço. O buffer de carga também inclui corantes coloridos como xileno cianol e azul de bromofenol usado para monitorar o progresso da eletroforese. As amostras de ADN são carregadas com uma pipeta.
Electroforesisedit
Agarose gel slab in electroforese tank with bands of dyes indicating progress of the electroforesis. O ADN move-se para ânodo.,
a electroforese em gel de Agarose é mais frequentemente feita horizontalmente num modo submarino em que o gel de laje está completamente submerso em tampão durante a electroforese. Também é possível, mas menos comum, realizar a electroforese verticalmente, bem como horizontalmente com o gel levantado nas pernas de agarose utilizando um aparelho adequado. O tampão utilizado no gel é o mesmo que o tampão de correr no tanque de electroforese, razão pela qual a electroforese no modo submarino é possível com gel de agarose.,
para uma resolução óptima de ADN superior a 2 kb de tamanho na electroforese em gel padrão, recomenda-se 5 a 8 V/cm (a distância em cm refere-se à distância entre eléctrodos, pelo que esta tensão recomendada seria de 5 a 8 multiplicada pela distância entre os eléctrodos em cm). A tensão também pode ser limitada pelo fato de que aquece o gel e pode causar a fusão do gel se for executado em alta tensão por um período prolongado, especialmente se o gel usado é gel de agarose LMP. Uma tensão muito alta também pode reduzir a resolução, bem como causar faixas de banda para grandes moléculas de DNA., Uma tensão demasiado baixa pode levar ao alargamento da banda para pequenos fragmentos de DNA devido à dispersão e difusão.uma vez que o ADN não é visível à luz natural, o progresso da electroforese é monitorizado utilizando corantes coloridos. O xileno cianol (cor Azul claro) comigraça grandes fragmentos de DNA, enquanto o azul bromofenol (azul escuro) comigraça com os fragmentos menores. Corantes menos comumente usados incluem vermelho de Cresol e laranja G que migram à frente do azul de bromofenol. Um marcador de DNA também é executado em conjunto para a estimativa do peso molecular dos fragmentos de DNA., Note no entanto que o tamanho de um DNA circular como plasmídeos não pode ser medido com precisão usando marcadores padrão, a menos que tenha sido linearizado por restrição digest, alternativamente, um marcador de DNA supercoiled pode ser usado.
coloração e visualização edit
o gel com iluminação UV: o ADN manchado com brometo de etídio aparece como faixas de laranja brilhante.
DNA bem como RNA são normalmente visualizados através da coloração com brometo de etídio, que se intercalam nos principais sulcos do DNA e fluorescem sob luz UV., A intercalação depende da concentração de DNA e, portanto, uma banda com alta intensidade irá indicar uma maior quantidade de DNA em comparação com uma banda de menor intensidade. O brometo de etídio pode ser adicionado à solução de agarose antes de gelar, ou o gel de ADN pode ser manchado mais tarde após a electroforese. A descoloração do gel não é necessária, mas pode produzir melhores imagens. Outros métodos de coloração estão disponíveis; exemplos são SYBR Verde, GelRed, azul de metileno, azul de cresilo brilhante, sulfato de azul de Nilo e violeta de cristal., O SYBR Green, o GelRed e outros produtos comerciais semelhantes são vendidos como alternativas mais seguras ao brometo de etídio, uma vez que se demonstrou ser mutagénico no teste de Ames, embora a carcinogenicidade do brometo de etídio não tenha sido realmente estabelecida. SYBR Green requer o uso de um transiluminador de luz azul. DNA manchado com violeta de cristal pode ser visto sob luz natural sem o uso de um transiluminador UV que é uma vantagem, no entanto, pode não produzir uma banda forte.quando manchado com brometo de etídio, o gel é visto com um transiluminador ultravioleta (UV)., A luz UV excita os elétrons dentro do anel aromático de brometo de etídio, e uma vez que eles retornam ao estado do solo, a luz é liberada, tornando o complexo de DNA e brometo de etídio fluorescente. Padrão transilluminators usar comprimentos de onda de 302/312-nm (UV-B), no entanto a exposição do DNA à radiação UV por apenas 45 segundos pode produzir danos ao DNA e afeta procedimentos subsequentes, por exemplo, reduzir a eficiência de transformação, de transcrição in vitro, e a PCR. A exposição do ADN à radiação UV deve, por conseguinte, ser limitada., O uso de um comprimento de onda superior a 365 nm (gama UV-A) causa menos danos ao DNA, mas também produz fluorescência muito mais fraca com brometo de etídio. Onde vários comprimentos de onda podem ser selecionados no transilumintor, o comprimento de onda mais curto seria usado para capturar imagens, enquanto o comprimento de onda mais longo deve ser usado se for necessário trabalhar no gel por qualquer período de tempo prolongado.
O aparelho transiluminador também pode conter dispositivos de captura de imagens, como uma câmera digital ou polaroid, que permitem que uma imagem do gel seja tomada ou impressa.,para a electroforese em gel de proteínas, as bandas podem ser visualizadas com Coomassie ou manchas de prata.
cortar fatias de gel de agarose. O equipamento de protecção deve ser usado quando se utiliza um transiluminador UV.
procedimentos a jusante edit
as bandas de ADN separadas são frequentemente utilizadas para outros procedimentos, e uma banda de ADN pode ser cortada do gel como uma fatia, dissolvida e purificada., Contudo, os contaminantes podem afectar alguns procedimentos a jusante, como a PCR, e a agarose de baixo ponto de fusão pode ser preferida em alguns casos, uma vez que contém menos sulfatos que podem afectar algumas reacções enzimáticas. O gel também pode ser usado para técnicas de blotting.