00:00:05.18 en la primera conferencia traté de articular para ti
00:00:08.02 por qué la fosforilación de proteínas es tan fundamental para la biología.
00:00: 11.25 lo que me gustaría hacer aquí es profundizar más en la estructura y función de la proteína quinasa.
00:00:19.17 y si miramos PKA, PKA es, de nuevo, un prototipo de quinasa que entendemos mejor.
00:00:28.18 y se activa mediante la Unión de neurotransmisores hormonales al exterior de una célula
00:00:37.00 en este caso adrenalina. Siempre…la adrenalina funciona igual que el glucagón.00: 00: 40.,25y cada vez que secretes adrenalina en tu torrente sanguíneo
00:00:43.21 estás activando PKA y te estás uniendo a un receptor acoplado a proteína G.
00:00:48.11 estás pasando por una subunidad g alfa y te estás conectando a la adenilato ciclasa,
00:00:53.08 lo que conduce a la generación de AMP cíclico.
00:00:56.12 y en este caso, PKA, de nuevo, está inactivo y se activa cuando
00:01:03.22 AMP cíclico se une a las subunidades reguladoras y luego se libera la actividad catalítica.
00:01:09.02 Y hay muchos sustratos.
00:01: 10.10 así que voy a centrarme aquí en la subunidad catalítica., ¿Cómo funciona eso como catalizador?
00:01:16.03 y la próxima vez hablaremos de cómo se mantiene en este estado latente por las subunidades reguladoras
00:01:21.25 y cómo se dirige a sitios específicos por proteínas de andamio.
00:01: 25.25 pero, hoy quiero centrarme en la quinasa.
00:01: 28.07 así que si volvemos a esta historia de la quinasa, empezamos a encontrar…
00:01:35.17 hay muchas proteínas quinasas y esto vino de la clonación de muchas proteínas diferentes.
00:01: 41.25 así que podrían obtener muy rápidamente la secuencia.00:01:43.,24en lugar de hacer esta secuencia de la manera difícil, químicamente haciendo esa secuencia.
00:01: 49.15 así que la primera secuencia de proteína quinasa fue PKA. Fue resuelto por Tatoni en 1981.
00:02:00.11 y sirvió entonces como plantilla, como marco.
00:02: 05.13 tuvimos…Les dije que Src fue clonado en 1979 pero no fue hasta que PKA fue secuenciado
00:02:11.03 que Margaret Dayhoff se dio cuenta de que Src estaba relacionado con PKA. Las dos secuencias estaban relacionadas.
00:02: 18.12 así que eso es lo que los puso en el mismo árbol aquí.
00:02:21.02 y luego en 1991, hicimos la primera estructura de una proteína quinasa.00:02: 25.,10y eso nos permitió ver las características tridimensionales de esta familia de enzimas.
00:02:32.07 entonces, déjenme decirles el tipo de información que obtuvimos de cada uno de esos hallazgos.
00:02: 40.04 así que aquí está el kinome. El kinoma se basa únicamente en el análisis de secuencias.
00:02: 46.03 y la mayoría de los genomas ahora tienen alrededor del 2% de su genoma está codificando proteínas quinasas.
00:02: 54.11 y las plantas son las ganadoras. Tienen el 4%. Tienen la mayoría de las proteínas quinasas.00:02:59.04 así que es una de las familias de genes más grandes en todos los organismos eucariotas.00:03: 05.26 si miramos la secuencia., Entonces, ¿qué nos dice la secuencia?
00:03: 10.07 nos dice eso…esta es una descripción química de su molécula.
00:03:15.10 pueden ver cómo a partir de esa secuencia,
00:03: 18.00 podríamos saber inmediatamente que el Src clonado es un homólogo de PKA.
00:03: 23.11 y luego podríamos hacer cosas químicas; modificación con un análogo de ATP, aquí modificado lisina 72.
00:03: 31.08 eso nos dijo que esta lisina estaba cerca del sitio activo, cerca del sitio de unión al ATP.00:03: 36.06 y también…más tarde demostramos que se podía
00: 03: 40.,25cross-vincularlo a dos residuos de ácido carboxílico diferentes, residuos ácidos.
00:03:47.07 para que los tres residuos, que están muy separados en la secuencia lineal,
00:03:52.00 deben estar muy juntos y cerca del sitio activo de la proteína plegada.
00:03:57.07 y luego la otra pieza de información aquí es el sitio de fosforilación,
00:04: 02.01 que es esencial para la actividad y que se asoció con esta treonina en particular.
00:04: 10.02 así que esos son los pedacitos de información que teníamos.
00:04:12.09 podrías tomar esas dos quinasas,
00:04:16.,02una vez que sabías que Src y PKA estaban relacionados y otras quinasas se clonaron.
00:04:20.04 el hallazgo inicial fue de Margaret Dayhoff que Src y PKA estaban relacionados
00:04: 25.10 y tenían muchos residuos conservados.00:04:28.02 y luego Tony Hunter…Hanks y Hunter hicieron un análisis de los subdominios
00:04:35.13 y dilucidaron estos diversos subdominios, cada uno con un motivo específico.
00:04: 39.09 y esos subdominios realmente han aguantado con el tiempo como la definición del núcleo de la proteína quinasa.
00:04:47.20, Pero luego, cuando tuvimos la estructura, ahora podemos empezar a entender
00:04:52.,15cómo esos motivos se pliegan juntos para formar una quinasa activa.
00:04:57.09 así que ahora pueden comenzar a mapear esa secuencia
00:05:03.22 de manera más completa en un marco estructural.
00:05: 07.18 así que aquí mostramos los dos dominios principales que se conservan en la familia quinasa.
00:05: 12.17 uno, el lóbulo pequeño, se asocia principalmente con la Unión de ATP.
00:05: 16.12 el Grande tiene muchos residuos asociados con la Unión de péptidos y la catálisis.
00:05: 21.28 esos son los residuos conservados y pueden ver que están esparcidos por todo el núcleo de la quinasa.00:05:27.,02también tiene este sitio de fosforilación aquí. Esto es esencial para su actividad.
00:05: 33.01 y otro sitio de fosforilación aquí en el C-terminal, fuera del núcleo.
00:05:37.18 OK, así que este es el lóbulo N y este es el lóbulo C.
00:05: 41.26 OK, así que ahora podemos tener una comprensión más profunda de esos motivos.
00:05: 48.09 y esto es lo que ahora sabemos es el núcleo conservado que es compartido por todas esas proteínas en ese árbol de kinoma.
00:05: 56.25 todos tienen este elemento común.
00:06:02.09 OK, así que si miramos diferentes ejemplos,
00:06:05.,27 Te he mostrado PKA, anteriormente hablé de Src aquí abajo con sus dominios SH3 y SH2.
00:06: 13.15 estas son solo algunas otras quinasas. Y pueden ver que la PKA es en realidad un poco inusual
00:06: 19.06 en que tiene un small…it tiene pequeñas colas en cada extremo, pero es sobre todo
00: 06: 26.04 el dominio quinasa y su parte reguladora es una subunidad separada the la subunidad reguladora.
00:06: 33.00 mientras que otras quinasas tienen dominios fusionados: C1 y C2 Unidos a PKC.
00:06: 37.21 se unen al calcio y al diacil-glicerol.
00:06: 41.,01cyclic GMP proteína quinasa, muy similar a PKA, sólo es cíclico GMP dominios de unión se fusionan con el núcleo de la quinasa.
00:06: 48.12 así que todos tienen en común el núcleo de la quinasa pero cada uno tiene estas variaciones.
00:06:54.18 así que ahora, de nuevo, si vuelves al núcleo,
00:06:58.23 puedes mapear esos subdominios en el núcleo de quinasa.
00:07:03.22 así que voy a mostrarles, de nuevo, cómo estos ahora se correlacionan con el lóbulo N y el lóbulo C.
00:07: 10.20 y contarles un poco más sobre los dos lóbulos también.00:07: 13.,14 Aquí está ahora la secuencia de PKA donde podemos mapear la estructura secundaria;
00:07:20.00 una hélice versus una hebra beta. Puedes asignarlo a esos subdominios
00: 07: 24.22 y tener un contexto tridimensional para esos subdominios.
00:07:30.12 así que aquí están esos subdominios mapeados en el núcleo de PKA y codificados de nuevo por colores.
00:07: 38.14 así que pueden ver los subdominios que comprenden cada uno de estos lóbulos, todo el núcleo conservado.
00:07:47.06 y, voy a guiarlos a través de estos muy rápidamente
00:07:50.09 solo para mostrarles algo de información sobre estos.
00:07: 54.25 así que, este es el primer encendido., Subdominio I es lo que llamamos el bucle rico en gylcine.
00:08: 00.03 y aquí pueden ver el bucle rico en gylcine aquí.
00:08: 03.21 pueden ver los 3 gylcines que se conservan en la mayoría de las quinasas arriba en la parte superior.
00:08: 08.21 y las características pueden comenzar a ordenar cuáles son las características que hace este motivo.
00:08:15.01 y luego es seguido por subdominio II.
00:08: 18.10 aquí está esa lisina, esa K. esa es la lisina que es modificada por el análogo ATP.00:08: 24.02 esta es la hélice C. Este es el único elemento helicoidal que se encuentra en el lóbulo pequeño.
00:08: 32.08 y luego tienes otro capítulo beta.,
00:08: 37.07 y luego tienes este subdominio V que enlaza los dos dominios.
00:08: 43.12 esta hebra beta está en el lóbulo N Y Esta hélice está en el lóbulo C.00:08: 49.25 y esta pequeña pieza que los une es el enlazador que une los dos lóbulos.
00:08: 55.09 y luego la E-helix. Esta es una hélice muy hidrofóbica.
00:09: 00.01 y el bucle catalítico.
00:09:02.11 Esto va a ser esencial para la catálisis. Es una pequeña hoja beta que está en el lóbulo C.
00:09: 09.04 y esta es otra parte de esa hoja beta. Este es el bucle de activación.00:09: 15.,14y así que voy a hablar de estos en más detalle.00:09:18.03 esta es la hélice F very muy, muy importante. Toda esta molécula está organizada alrededor de esta hélice F.
00:09: 25.05 es inusual en que va justo a través del medio del lóbulo C.00:09: 29.20 es muy hidrofóbico. Al analizarlo pensarías que es una hélice que atraviesa la membrana.00:09:35.04 extremadamente hidrofóbico.
00:09: 37.14 y luego esta g-hélice sirve como un sitio de acoplamiento para proteínas y H-hélice.
00:09:42.10 y aquí solo para mostrarles un ejemplo comparando los subdominios de PKA y Src,
00:09:48.,10puede ver que hay pocas diferencias, pero en general, esos subdominios se conservan.
00:09: 53.10 el pliegue se conserva en todas esas proteínas quinasas, todas esas 500.
00:09:58.28 por lo tanto, voy a hablarles de estos lóbulos primero
00:10:02.06 porque creo que les dará una comprensión de cómo esos subdominios trabajan juntos
00:10: 07.02 sinérgicamente para crear una quinasa activa.
00:10:10.00 y este es el lóbulo N y contiene este bucle rico en glicina
00: 10: 15.02 del que les hablé. Esas son las tres glicina.00: 10: 17.,16y entonces la c-hélice es la otra característica realmente conservada aquí.00: 10: 22.09 y pueden ver la lisina 72 y Glu91.00: 10: 26.03 esos son los residuos que fueron unidos por nuestros estudios químicos.
00:10:30.14 así que cuando vimos por primera vez esta estructura, lo primero que hice fue decir,
00: 10: 34.07″¿Dónde está la lisina? ¿Y dónde están esos residuos que se cruzan con él?»
00: 10: 37.19 y así fue…estaban bien uno al lado del otro tal y como pensamos en los estudios químicos.
00: 10: 43.17 pero no podíamos entender cómo se relacionaban hasta que vimos esa estructura.,
00: 10: 49.04 OK, así que el bucle de glicina es la parte más móvil de la quinasa.
00: 10: 58.18 y tiene que abrir y cerrar.
00:11:01.08 y cuando se cierra encaja en la parte superior del fosfato gamma de ATP
00: 11: 05.28 y lo posiciona para ser transferido a un sustrato proteico.00: 11: 11.08 así que esta apertura y cierre del bucle de glicina es esencial para la catálisis.
00: 11: 16.01 y ese enlace de hidrógeno entre el bucle de glicina y el fosfato gamma de ATP es crítico.00: 11: 26.22 ahora vamos al lóbulo grande.00: 11: 28.,17 así que es en su mayoría helicoidal, pero tiene esta hoja beta que está justo en la hendidura del sitio activo.
00:11:33.20 y algunos de esos residuos conservados se encuentran aquí en estos dos bucles
00: 11: 39.18 y esos son muy esenciales para transferir ese fosfato.
00: 11: 42.29 y que se encuentra en la parte superior de este subdominio helicoidal muy estable.00:11:48.03 el lóbulo N es muy maleable. Este lóbulo es muy, muy estable.
00:11:53.00 y algunas características clave que el fosfato que es importante para activar la quinasa
00: 11: 59.16 está aquí, y cuando fosforila ese sitio, el sitio activo es máximo activo.,00: 12: 10.10 sin ese fosfato no está activo.
00: 12: 12.09 así que aunque está a 20 angstroms del sitio activo, es esencial crear la quinasa activa.
00:12:18.15 y sin esa fosforilación, la enzima realmente se despliega muy fácilmente
00: 12: 23.16 y sus propiedades químicas son silenciosamente diferentes.00: 12: 27.02 un fosfato, solo un fosfato.00: 12: 30.02 este es el bucle catalítico. Muchos de los residuos catalíticos que son importantes.00: 12: 34.07 este bucle P+1 es importante para acoplar sustratos de péptidos.00: 12: 40.,11So, si nos fijamos en una imitación de lo que creemos que podría ser un estado de transición para transferir el fosfato,
00:12:47.06 este es el…el fluoruro de aluminio sirve como un imitador para el fosfato gamma de ATP
00:12:54.19 y tienes los residuos del bucle catalítico en el lóbulo C,
00:12:58.17 los residuos del bucle rico en glicina en el lóbulo N.
00: 13: 01.15 convergen en ese fosfato gamma y lo transfieren al sustrato peptídico.
00: 13: 06.17 así que, muy hermosa química de cómo estos se unen en el sitio activo.
00: 13: 12.05 así que veamos, por un momento, la catálisis.,
00: 13: 15.03 por lo tanto, la quinasa debe abrirse y cerrarse como parte de su ciclo catalítico.
00: 13: 20.19 así que, cuando está abierto, en realidad es maleable.
00:13:24.28 entonces, se une ATP y sus sustratos peptídicos y aquí, para ese momento transitorio de catálisis,
00: 13: 32.05 está en una conformación cerrada.
00:13:34.08 así que, si miramos cómo se ven en la molécula, esta es la conformación abierta a la izquierda
00: 13: 44.20 donde tienes un agujero allí, ahí es donde el ATP va a encajar en ese agujero grande.00: 13: 48.,19y luego de la conformación cerrada, se puede ver cómo esa hendidura del sitio activo realmente baja y se cierra.00: 13: 55.09 y ahora, en esto…esto sólo va a darle una imagen de cómo esta quinasa se abre y se cierra.
00: 14: 01.19 y está transformando los Estados abierto y cerrado.
00: 14: 03.24 y solo voy a señalar, antes de ver la película, La lisina 72 y la Glu91.
00: 14: 09.22 esos fueron dos de los residuos que se entrecruzaron.
00: 14: 11.24 así que ahora pueden tener una idea de cómo se está llevando a cabo la apertura y el cierre de la hendidura del sitio activo.00: 14: 21.,11y esto es sólo un morphing the La conformación abierta y la conformación cerrada,
00:14:25.25 esencialmente la respiración de una molécula de proteína quinasa.
00:14:30.21 OK, así que si miramos de cerca ahora en esa conformación cerrada donde el ATP está ligado,
00: 14: 37.06 se puede ver que la mayor parte del ATP está enterrado en ese agujero profundo allí.
00:14:40.22 y solo el pequeño fosfato gamma sobresale en el borde de la interfaz
00: 14: 46.12 entre el bucle rico en glicina del lóbulo N y el bucle catalítico del lóbulo grande.
00: 14: 53.00 y luego pueden ver aquí cómo un péptido encaja en ese sitio.,
00: 14: 57.01 por lo tanto, se acopla principalmente en el lóbulo grande.
00:15: 00.27 Aquí está el residuo P+1. Es un bonito, en este caso, bolsillo hidrofóbico
00:15:04.20 donde se acoplan los residuos hidrofóbicos.
00: 15: 07.29 este es un pseudo-sustrato. Es una alanina en lugar de una serina.00: 15: 11.06 si eso fuera una serina aceptaría el fosfato y transferiría el fosfato.
00:15:16.08 y luego, a PKA le gustan los residuos básicos y así tienes residuos ácidos en la proteína en rojo
00: 15: 23.06 que reconocen esos aminoácidos básicos en el péptido.00: 15: 26.,09And entonces para el péptido del inhibidor que se une adentro…este es un péptido de unión de afinidad muy alta.
00: 15: 35.17 tiene una hélice que se acopla a la hendidura del sitio activo y esto sirve como un sitio de anclaje.
00: 15: 45.08 así que les he dicho cómo funciona el PKA. Es la quinasa que entendemos mejor en términos de estructura y función.
00:15:53.10 Pero ahora tenemos todo este quinoma árbol.00: 15: 55.22 y, ¿qué podemos aprender ahora de una familia numerosa?00: 16: 02.15 tenemos…debido a que son tan importantes para las enfermedades, tenemos muchas estructuras quinasas.00: 16: 07.,Las 17kinasas se han convertido en un objetivo importante para el descubrimiento de fármacos. Así que tenemos muchas quinasas.
00: 16: 12.22 así que les he mostrado lo que podemos aprender del análisis profundo de una quinasa.
00:16:18.13 ¿qué podemos aprender de este kinoma estructural ahora donde tienes
00: 16: 22.26 no solo muchas secuencias sino que tienes muchas estructuras?
00: 16: 26.16 y, podemos aprender diferentes tipos de cosas.
00: 16: 28.28 voy a contarles algunas lecciones globales que podemos aprender sobre toda la familia.
00:16:32.10 Uno puede profundizar en una sola familia
00:16:35.,05y descubre cuáles son las características únicas de una subfamilia frente a otra.
00: 16: 39.27 así que esto es sólo seis de las diferentes estructuras de quinasa, núcleos de quinasa.
00: 16: 47.25 y se puede ver que los subdominios se conservan en su mayoría en todas estas quinasas.00: 16: 53.22 ¿qué podemos aprender de ese kinoma estructural?00:16:59.04 una de las cosas que hicimos fue desarrollar un método que llamamos alineación de patrones espaciales locales.
00: 17: 07.01 y esto es simplemente comparar rápidamente dos estructuras cualesquiera y mirar los residuos espacialmente similares.
00: 17: 15.09 y esto te proporciona un patrón.,
00: 17: 18.05 puedes hacer esto independientemente de cualquier alineación de secuencia.
00: 17: 20.25 solo dos estructuras, compárelas.
00: 17: 23.07 y se obtienen figuras como esta que muestran la relación espacial de los residuos en dos proteínas quinasas.
00:17:34.00 y si miramos aquí pueden ver un par de residuos clave
00: 17: 38.09 que estos bordes indican un enlace espacial entre dos aminoácidos.
00: 17: 46.23 y cuantos más bordes tenga un aminoácido en particular, mayor será su puntuación de compromiso.
00: 17: 52.15 llamamos a eso una puntuación de implicación.00: 17: 54.,24 así hacemos una red de residuos espaciales relacionados en dos proteínas quinasas.
00: 18: 01.24 y esto se llama la puntuación de implicación. Cuanto mayor sea la puntuación de compromiso,
00: 18: 05.15 más aminoácidos relacionados espacialmente interactúan con ese aminoácido en particular.
00: 18: 12.24 así que usamos esto primero para comparar quinasas activas e inactivas.00: 18: 20.04 ¿qué es diferente?
00:18:21.06 ¿puedes encontrar diferencias relacionadas espacialmente que sean únicas para
00: 18: 28.01 la quinasa activa y que no estén allí en la quinasa inactiva?
00: 18: 31.06 y a partir de este análisis definimos lo que llamamos una columna vertebral.,
00:18:38.06 posteriormente lo hemos llamado una columna reguladora
00:18:42.00 es una columna hidrofóbica que se conserva espacialmente en cada quinasa activa
00: 18: 47.12 y se rompe cuando la quinasa está inactiva.00: 18: 50.22 y está hecho de residuos hidrofóbicos.00: 18: 53.02 provienen de residuos no contiguos. Así que uno viene de beta-4, uno es de Alfa-C,
00: 18: 59.16 uno es del motivo DFG, uno es del motivo HRD, dos están en el lóbulo N, dos están en el lóbulo C.00: 19: 08.14 y se alinean para hacer esta columna hidrofóbica.00: 19: 12.,00You nunca encontraría esto por comparaciones de secuencia
00:19:15.11 porque, por análisis de secuencia, no son contiguos
00:19:17.26 pero están espacialmente bien definidos como un motivo conservado.
00:19:25.20 así que luego volvimos y miramos todas las quinasas
00: 19: 29.00 y encontramos que en realidad había dos espinas.
00: 19: 34.03 y así encontramos una segunda columna vertebral, que llamamos la columna catalítica, además de la columna reguladora.
00:19: 40.22 y la importancia de…de nuevo, son residuos hidrofóbicos que provienen tanto del lóbulo N como del lóbulo C.00: 19: 48.,04la cosa única sobre la columna catalítica es que es el anillo de adenina del ATP que
00:19:52.19 completa la columna vertebral y une los dos.
00: 19: 54.26 eso significa que una vez que agregas ATP, ahora tienes una nueva coordinación entre el lóbulo N y el lóbulo C.
00: 20: 04.02 así que la otra característica que vino de este análisis es Esta hélice F.
00: 20: 08.09 esta es una hélice muy hidrofóbica que se extiende por el lóbulo C.00: 20: 12.06 esto es muy inusual para una proteína globular como una quinasa.
00: 20: 17.02 pero, está muy bien conservado y sirve como marco…00: 20: 22.,22se vincula tanto a la columna reguladora como a la columna catalítica
00: 20: 29.05 y nucleates…it realmente proporciona la arquitectura en la que se ensambla una quinasa activa.
00: 20: 36.27 y llamamos a esto el motivo S2H o dos espinas y una hélice.
00: 20: 41.19 y esa es realmente la arquitectura fundamental que toda proteína quinasa.
00: 20: 46.21 así que, aquí les muestro solo esa hélice F.
00: 20: 49.12 pueden ver cómo pasa por el medio de este lóbulo C.
00: 20: 55.02 nunca se podría predecir que esto era parte de una proteína globular por análisis de secuencia.00: 21: 01.,10y se puede ver, como esto gira alrededor, la relación de esa hélice F con el resto de la proteína.00: 21: 13.06 realmente…todo está nucleado alrededor de esa hélice F.
00:21:16.25 pueden ver algunos de los residuos clave que emergen
00: 21: 20.29 que van a ser importantes para enlazar a las dos espinas que están saliendo de esa hélice F.
00:21:26.26 allí pueden ver las dos espinas,
00:21:28.04 cómo esas dos espinas están realmente ancladas de una manera muy fundamental a la hélice F
00: 21: 33.10 y al bucle catalítico. Todos los elementos funcionales están realmente vinculados a esta hélice F.,
00:21:44.12 así que, de nuevo, pueden ver aquí, cuando abren y cierran la quinasa,
00: 21: 48.22 esas conformaciones…pueden ver que las dos espinas permanecen intactas como parte de ese movimiento respiratorio.00: 21: 55.10 no interfiere con el movimiento respiratorio de la quinasa.
00:22:02.03 así que, les daré un ejemplo aquí de la…este es el receptor de insulina,
00:22:06.15 otro miembro de esa rama de la tirosina quinasa.
00:22:11.03 y esta es la conformación activa del receptor de insulina y pueden ver que
00: 22: 15.00 las dos espinas están intactas., Esta es una conformación totalmente activa de la quinasa del receptor de insulina.
00:22:20.27 cuando no está activo (y se activa por fosforilación de su bucle de activación aquí),
00:22:28.06 cuando no está fosforilado en su bucle de activación,
00: 22: 31.13 entonces se puede ver la columna vertebral rota.00: 22: 33.25 y esta es una forma en la que se puede romper.
00:22:37.28 en realidad, un residuo de la columna reguladora va y llena la bolsa de adenina
00: 22: 43.07 para la columna catalítica.
00: 22: 44.10 pero hay muchas, muchas variaciones de cómo puedes romper esa columna vertebral.00: 22: 49.,20así, ¿por qué es tan importante ese fosfato?
00: 22: 53.00 hablé de que este fosfato es realmente importante.00: 22: 58.08 es importante para el receptor de insulina. Es importante para PKA.00: 23: 02.04 ese fosfato en el bucle de activación…
00: 23:04.22 y sólo voy a mostrarles:aquí hay un fosfato en PKA
00:23:08.22 y está haciendo siete diferentes interacciones electrostáticas o de enlace de hidrógeno
00: 23: 17.10 con diferentes residuos de cadenas laterales.00: 23: 20.09 y es un sitio de fosforilación tan integrador.00: 23: 24.,19SE va a esta histidina que está en la hélice C, En el subdominio 3.
00: 23: 30.10 va a lisina 189 que en realidad está en la beta-hebra 9.00: 23: 37.26 va a arginina 165 que justo antes del bucle catalítico.00: 23: 44.26 e integra todo este bucle de activación.
00: 23: 48.24 por lo tanto, está jugando un papel crítico en la integración de todos los subdominios de la proteína.
00:23:56.18 así que en esta última parte quería volver a las quinasas y la enfermedad
00: 24: 00.07 y de nuevo, relacionarme con lo que les dije sobre estos subdominios y las espinas.00:24:08.,25hay probablemente más ahora, pero al menos el 30% de las quinasas están implicadas en varias enfermedades
00:24:13.28 y eso está creciendo todo el tiempo a medida que profundizamos más en las diferentes quinasas.
00:24:20.08 es probable que muchos más sigan a medida que obtenemos más y más información genómica
00: 24: 24.21 y correlaciones de enfermedades.
00:24:28.10 las quinasas son tratables como objetivos de drogas porque pueden inhibirlas y
00: 24: 34.00 voy a mostrarles un ejemplo de eso.00: 24: 36.01 este es el kinoma humano y les estoy mostrando una quinasa en la rama de tirosina.00: 24: 42.,28este es Abl, un pariente de Src.
00:24:46.07 y en esta enfermedad fatal leucemia mylogenosa crónica
00: 24: 51.23 es esta Abl la que se modifica. Se fusiona con otra proteína y lo convierte en un oncogén.00: 24: 56.27 por lo tanto, es constitutivamente activo. Está encendido todo el tiempo.00: 24: 59.23 Eso es lo que hace que un oncogén you no puedes apagarlo.
00: 25: 03.03 entonces, este Gleevec fue descubierto como un inhibidor muy específico de BCR-Abl.00: 25: 12.07 y esta es la verdadera prueba de principio que dice que las quinasas son dianas de fármacos muy manejables.00: 25: 23.,07Si miramos Abl con ATP unido a él, pueden ver aquí las dos espinas;
00: 25: 28.09 la espina reguladora, la espina catalítica. Esto es Abl activo.
00:25:32.16 y luego comparan eso ahora con la estructura donde Gleevec está enlazado
00: 25: 37.17 y esto fue hecho por el laboratorio de John Kuriyan.
00:25:42.04 está unido a la hendidura del sitio activo, pero se puede ver cuando Gleevec se une,
00:25:46.22 la columna reguladora está rota y por lo tanto en realidad está tejiendo a través
00: 25: 52.07 tanto la columna catalítica como la columna reguladora.
00:25:57.10 por lo que se une a una conformación inactiva
00: 25: 59.,12y usted puede ver con precisión las características que están siendo aprovechadas por Gleevec.
00:26:05.03 por lo tanto, uno de los sitios que se asocia con frecuencia con la resistencia a Gleevec
00: 26: 11.20 es una mutación de este residuo de treonina en el bolsillo de unión de ATP aquí.
00: 26: 17.10 así que esta treonina a veces se conoce como el gatekeeper.
00:26:20.04 Y creo que en la diapositiva anterior…aquí está el residuo del portero.00: 26: 25.09 les muestro DÓNDE ESTÁ el residuo del gatekeeper.00: 26: 27.09 es una treonina. Y la mutación que ocurre a menudo es que se convierte en metionina.,00: 26: 33.10 así que la treonina es un pequeño residuo. La metionina es un residuo mucho más voluminoso.00: 26: 37.24 es tan voluminoso que evitará que Gleevec se ate.00: 26: 41.15 es un obstáculo estérico así que bloquea eso.
00:26:43.19 pero, hace más que eso y este estudio reciente de Daley y Kuriyan muestra que
00:26:51.07 cuando tienes la metionina allí en lugar de la treonina,
00:26:55.08 la metionina es un residuo hidrofóbico agradable y llena un vacío entre
00:27:01.22 la columna catalítica y la reguladora y lo que hace es que ahora crea una, columna vertebral activa.00:27:08.,06 Así que cambiando ese residuo, treonina, a una isoleucina (metionina),
00:27:13.17 no solo se elimina la Unión de Gleevec, también se crea un oncogén.
00: 27: 19.03 ahora han estabilizado esta columna reguladora de una manera que ya no requiere fosforilación.00: 27: 26.01 así que esto no solo es resistente a Gleevec, esta proteína es un oncogén.
00:27:35.06 por lo tanto, he hablado de los subdominios y cómo se conservan en la familia
00:27:39.26 y les he dado una apreciación de cómo funcionan las quinasas
00: 27: 42.,24y por qué son un objetivo tratable para el descubrimiento de fármacos
00:27:46.18 y luego de lo que quiero hablar la próxima vez es cómo las quinasas regulan
00:27:51.23 y para hacer eso realmente no vamos a estar tan interesados en la maquinaria catalítica,
00:27:56.01 vamos a estar realmente interesados en las superficies de la quinasa
00:27:59.18 y cómo PKA en particular se une a otras proteínas.00:28:04.04