Struttura e funzione della notocorda: un organo essenziale per lo sviluppo del cordato | Sviluppo

Ruoli della notocorda nello sviluppo dei vertebrati

Patterning

La notocorda ha diversi ruoli consolidati nel patterning dei tessuti circostanti. Poiché questi problemi sono stati esaminati in modo completo altrove(Cleaver e Krieg, 2001; Dodd et al., 1998; Hogan e Bautch, 2004; Holland et al., 2004), ho solomenzionare alcuni dei ruoli principali qui. Forse la migliore caratteristica è ilruolo della notocord nel modellare il tubo neurale., Una serie di esperimenticomportando sia il trapianto che la rimozione della notocorda durante lo sviluppo ha dimostrato che la notocorda può segnalare la formazione della piastra del pavimento, che è il destino ventrale del midollo spinale (Placzek et al., 1991; van Straaten et al., 1989; Yamada et al., 1991). Tra i segnali secreti dalla notocorda ci sono le proteine Hedgehog (Hh). SonicHedgehog, in particolare, induce una serie di destini del midollo spinale ventrale in modo graduale e contemporaneamente sopprime l’espressione dei geni caratteristici dorsali (Placzeket al., 1993; Yamada et al.,, 1993; Yamada et al.,1991). Rafforzando e mantenendo eventi di sviluppo precedenti, i segnali notocord sono anche coinvolti nello stabilire l’asimmetria LR; l’ablazione della notocord in Xenopus gastrulae porta alla randomizzazione dell’asimmetria (Danos e Yost,1995; Lohr et al.,1997). Nei teleostati, i segnali Hh derivati da notocord controllano la formazione del miosetto orizzontale, oltre a specificare i destini muscolari a contrazione lenta (Barresi et al., 2000; Devoto et al.,1996). I segnali derivati da notochord sono importanti per specificare ilformazione dell’aorta dorsale (Cleaver etal., 2000; Fekany et al.,, 1999; Isogai et al., 2003; Lawson et al., 2002), nonché per la normale specificazione del campo cardiaco(Goldstein e Fishman, 1998).Infine, la notocorda è importante per il normale sviluppo di earlyendoderm e del pancreas (Cleaver andKrieg, 2001; Kim et al.,1997).

Strutturale

Sebbene i ruoli di modellatura della notocorda siano essenziali per lo sviluppo normale dei vertebrati, la notocorda ha anche un ruolo strutturale essenziale.,La notocorda è il principale elemento scheletrico assiale dell’embrione precoce del cordato;senza una notocorda completamente differenziata gli embrioni non riescono ad allungarsi (Odenthal et al., 1996; Saúde et al., 2000; Schulte-Merker et al., 1992; Schulte-Merker et al., 1994; Stemple et al., 1996; Talbot et al., 1995). Per moltispecie, ciò si traduce nell’incapacità di nuotare correttamente, di sfuggire alla predazionee di nutrirsi. Alcuni comprensione di questa funzione del notochord è beenderived dagli studi delle mutazioni zebrafish (Driever et al., 1996; Haffter et al., 1996)., Un certo numero di loci coinvolti nella formazione di notocord sono stati identificati in diversi schermi sistematici su larga scala per mutazioni che interessano l’embriogenesi del pesce zebra(Fig. 3) (Odenthal et al., 1996; Stemple et al., 1996). Come ho discusso, alcuni dei loci identificati in questi schermi sono stati trovati importanti per la formazione delmoderma del cordame, evidenziando importanti ruoli di segnalamento della notocorda. La maggior parte dei loci, tuttavia, sono stati trovati per essere profondamente importante per gli aspetti strutturali della funzione notocord.,

Per comprendere la struttura della notocorda, è utile considerare la notocorda come parte di un sistema meccanico necessario per la locomozione(Fig. 4). Gli embrioni di Zebrafish, ad esempio, sono in grado di capovolgere la coda entro 1 giorno dalla fecondazione, e di catturare e nuotare entro 3 giorni. Per analogia, la notochord è come una manichetta antincendio, in possesso di una guaina forte ma flessibile che può resistere ad alte pressioni idrostatiche. Considera quindi una situazione in cui la manichetta antincendio è riempita conballoni d’acqua, ognuno spingendo contro l’altro e contro la guaina., In tale disposizione, la manichetta antincendio sarebbe allungata e rigida, ma in grado di piegarein qualsiasi direzione. Infine, con i cavi che corrono lungo la parte superiore e inferiore della manichetta antincendio, i cavi resisterebbero a qualsiasi flessione verso l’alto o verso il basso del tubo, e qualsiasi forza che agisce sulla manichetta antincendio lo devierebbe lateralmente.Per l’embrione di zebrafish, l’equivalente della manichetta antincendio è la membrana basale peri-notocordale e i palloncini d’acqua sono le cellule vacuolate del notocordo. Correndo lungo la parte superiore della notocorda è la piastra del pavimento eallungo il fondo è l’ipocordo., Coerente con questo ruolo strutturale, entrambila piastra del pavimento e l’ipocordo esprimono una varietà di proteine cartilaginee, come il collagene di tipo II (Yan et al.,1995). Inoltre, mutazioni in geni come oep e ciclopi (ndr2-Zebrafish Information Network), che portano a una sostanziale perdita di piastra del pavimento, producono anche embrioni con una profonda curvatura verso il basso (Hatta, 1992; Hatta et al., 1991; Schier et al.,1997). Così, sebbene non ancora direttamente stabilito, è possiblethat il piatto di pavimento e l’ipochord fungono da cavi sui lati andventral rispettivi dorsali del notochord.,

Nello zebrafish, la formazione della membrana basale peri-notocordale e del vacuolo sono influenzate ciascuna da due classi fenotipiche di mutazioni. Una classe, originariamente trovato per influenzare sia notochord e lo sviluppo del cervello, comprende thebashful, scontroso e assonnato loci. Questi loci sono stati recentemente trovati per codificare laminina α1 (timida), lamininß1 (scontrosa) e laminina γ1 (assonnata), che sono costituenti della membrana basale(Parsons et al., 2002) (S. M. Pollard, tesi di dottorato, University College London, 2002)., La seconda classe ofmutations è stato originariamente trovato per influenzare notochord e melanophore developmenteearly in embryogenesis, portando alla fine a catastrofica cellule deaththroughout embrioni mutanti. Questa classe comprende sneezy, happy anddopey, che codificano, rispettivamente, le catene α, β e y del complesso coatomer, che è un componente importante della via secretoria ed è essenziale per la sopravvivenza di tutte le cellule eucariotiche(Coutinho et al., 2004). Thecoatomer complesso sarebbe normalmente considerato per svolgere una funzione di custodia eucariotica., È sorprendente che la perdita di attività del coatomero ingli embrioni di ebrafish porterebbero a un fenotipo notocord. Una spiegazione è che il coatomero è fornito per via materna e che il notocordo formante è tra i primi tessuti in cui la domanda secretoria supera l’offerta materna. Questa perdita di attività secretoria porta alla perdita della membrana basale del notocordo e al fallimento della formazione del vacuolo. Insieme, la laminina zebrafish e coatomermutants evidenziano l’importanza della struttura notocord alla sua funzione.,

Laminine e struttura notocord

Le laminine sono complessi proteici eterotrimerici obbligati costituiti da catene ana, β e γ e sono parte integrante delle membrane basali.Le membrane basali sono strutture onnipresenti con ruoli diversi, ma lo sonodi solito associate a un epitelio. Tipicamente in una membrana basale, i trimeri di laminina polimerizzano per formare una rete, che è reticolata a una rete di collagene tipeIV da nidogeni (Colognato e Yurchenco,2000; Iozzo, 1998;Timpl e Brown, 1996;Yurchenco e O’Rear, 1994).,Inoltre, associati alle membrane basali sono eparina-sulfateproteoglicani (Iozzo, 1998).Le membrane basali sono importanti per definire i confini tra i tessuti, per la segnalazione tra le cellule e, in alcune situazioni,per fornire una forte barriera meccanica (Timpl e Brown, 1996). Quest’ultimo ruolo è di particolare importanza nel kidneyglomerulus, dove la membrana basale funge da parte integrante dell’apparato di filtrazione resistendo ad alte pressioni idrostatiche (Miner e Li, 2000). Questo èsimile al ruolo svolto dalla membrana basale peri-notocordale.,

Fig. 3.

Fasi dello sviluppo della notocorda colpite da mutazioni. Il passaggio dall’organizzatore del cavallo al cordamesoderma è influenzato da mutazioni in diversi genes.At la parte superiore della cascata delle specifiche dorsali sono le proteine andabod eß-catenina (Kelly et al.,2000). In loro assenza, i tipi ventrali di mesoderma possono formarsi manon cordamesoderma. Il bozozok e la testa fluttuante loci ciascunocodice omeodominio contenente proteine che sono necessarie per la chordamesodermspecification., In completa assenza di oep, come nelmutante materno-zigotico (Mz), il mesendoderma non è specificato, incluso ilcordamesoderma. I laminins (schivo, scontroso e assonnato),i coatomers (sneezy, felice e dopey), brachyury (notail) e uno sconosciuto locus, doc, sono tutti necessari per propernotochord differenziazione. Punte di freccia indicano (A) chordamesoderm progenitorregion dello scudo, (B) il chordamesoderm e (C) il differentiatednotochord.

Fig. 4.

Aspetti strutturali della notocorda., (A) Una vista laterale di una coda livezebrafish a 24 hpf, che mostra le caratteristiche principali della notocorda. Il dorso della notocorda è la piastra del pavimento, nella parte ventrale-la maggior parte della formazionecorda spinale. Ventrale alla notocorda è l’ipocordo. (B) Un diagramma schematico di sezioni laterali e trasversali della notocorda, che mostra la piastra del pavimento e l’ipocorda che fungono da cavi che corrono lungo la parte superiore e inferiore della notocorda. (C)Così come il notochord, la piastra del pavimento e ipocord expresstype II collagene (Yan et al.,1995). cc, canale centrale; fp, piastra del pavimento; hy, ipocordo; no,notocordo; nt, tubo neurale.,

Le lamine sono diverse, probabilmente riflettendo i loro diversi ruoli. Nell’umanoci sono cinque geni α, quattro β e tre γ che codificano per la laminina.Attraverso varie combinazioni di catene α, β e γ, sono state identificate ben 12 diverse isoforme di laminina (Colognato e Yurchenco,2000). In zebrafish, finora, la maggior parte dei geni della laminina può essere trovata nella sequenza genomica, sebbene solo alcuni siano stati sequenziati come cDNA a lunghezza intera.,

La clonazione posizionale del zebrafish schivo, scontroso andsleepy loci ha portato all’identificazione di tre catene laminin;α1, β1 e γ1 (Parsons etal., 2002) (S. M. Pollard, tesi di dottorato, University College London, 2002). I fenotipi mutanti di scontroso e assonnato sonoindistinguibile, mentre il fenotipo schivo è sempre più debole.,Durante lo sviluppo di embrioni mutanti scontrosi e assonnati,il fenotipo della notocorda diventa evidente quando i vacuoli non riescono a formarsi correttamente e quando i geni che sono caratteristicamente espressi dal cordamesoderma, come l’echidna hedgehog, non riescono a estinguersi, come farebbero durante la normale differenziazione della notocorda. L’analisi al microscopio elettronico della membrana basale peri-notocordale mostra che è completamente assente in questi mutanti e la colorazione anticorpale mostra una completa mancanza di immunoreattività di laminina 1 negli embrioni mutanti più gravemente colpiti scontrosi e dormienti., Negli embrioni mutanti timidi più deboli, la membrana basale peri-notocordale manca solo nelle regioni anterioreinfette della notocorda. Nella parte posteriore di questi embrioni, ilnotocordo è normalmente differenziato e ha immunoreattività laminina 1. Le differenze tra schivo e scontroso o assonnato sono dovute a una ridondanza tra catene laminin α. L’interruzione dell’espressione di laminina4 in embrioni mutanti schivi, che mancano di laminina1, porta al fenotipo grave notocord visto in mutanti grumpy andsleepy, e una completa perdita di immunoreattività della laminina 1 (S. M., Pollard, tesi di dottorato, University College London, 2002).

Queste quattro catene lamininiche – α1, α4, β1 e γ1– partecipano alla formazione del basamento peri-notocordalemembrana, e il cordamesoderma esprime mRNA per ogni catena. Ma il solo thenotochord rappresenta la laminina nella sua membrana basale? Questa domanda è stata affrontata da un test di innesto dell’organizzatore. In questi esperimenti, un organizzatore dorsale di tipo selvaggio è stato innestato nella regione ventrale di un embrione mutantost, o viceversa, e gli embrioni gemellati risultanti sono stati analizzati per la differenziazione morfologica notocord., Sorprendentemente, per entrambi i tessuti mutanti grumpy e sleepy, entrambi i tipi di innesti hanno portato allo stesso risultato, un notochord normalmente differenziato (Parsons et al., 2002). L’analisi dell’immunoreattività della laminina ha mostrato che quando l’organizzatore wild-type viene trapiantato in ospiti mutanti, le proteine della laminina 1 circondano ilnotocordo trapiantato. Pertanto, le lamine possono essere fornite da fonti notocordali extra o dalla notocordia stessa.

Fig. 5.

Membrana basale peri-notocordale., (A) La struttura tri-laminare della membrana basale peri-notocordale (tra le punte di freccia) mostrata utilizzando la microscopia elettronica, dalla guaina di una cellula notocorda wild-type. i, strato interno; m, strato mediale; o, strato esterno. (B)Questa struttura è interrotta nella morte di una cellula notocord mutante dopey, dove mancano gli strati esterni e medi. Lo strato interno è probabilmente costituito da laminina poiché (C)i livelli wild-type di immunoreattività della laminina sono chiaramente visibili in (D)embrioni mutanti starnuti, ma sono aboliti in (E) mutanti addormentati.,

Esiste una relazione tra differenziazione notocordica e la presenza della membrana basale. È probabile che ciò implichi la segnalazione dalla membrana basale al cordamesoderma. Lo stato di differenziazione può esseredeterminato dall’analisi dell’espressione genica. Ad esempio, l’echidnahedgehog, che è un omologo del pesce zebra del riccio indiano dei mammiferi, ènormalmente espresso in cordamesoderma, ma quando il notocordo si differenzia e i vacuoli si gonfiano, l’espressione del riccio di echidna si spegne(Currie e Ingham, 1996)., Nei mutanti, tuttavia, l’echidna hedgehog è persistentemente espresso(Parsons et al., 2002). Bycontrast, quando il notochord mutante si sviluppa in uno sfondo wild-type, thenotochord si differenzia normalmente, suggerendo che viene ricevuto un segnale residente nella membrana di base. Una possibilità è che laminin stesso è ilsegnale. Ci sono molti recettori della laminina di superficie cellulare,ma interrompere severalof questi recettori non riesce a copiare il fenotipo laminina perdita di funzione, anche se altri fenotipi sono evidenti., Un’altra possibilità è che un altrosegnale residente nella membrana basale funge da notocord differenziazionecue. La presenza di proteoglicani eparina-solfato nelle membrane basali in generale, e in particolare nelle membrane basali notocord, fornirebbe il contesto corretto per una varietà di proteine solubili del fattore di crescita. La natura del segnale di differenziazione notocord, tuttavia, rimane da risolvere.

Questi studi dimostrano che la formazione di una membrana basale peri-notocordale è essenziale non solo per la struttura della notocorda, ma anche per la differenziazione del notocordo., In effetti, la perdita di molti altri geni che non lo sonocomponenti della membrana basamentale, di per sé, ma che influenzano la formazione della membrana basaleperi-notocordale, influisce anche sulla differenziazione delnotocordo.

Coatomers e struttura notochord

Simile ai mutanti laminin assonnati e scontrosi,i mutanti sneezy, happy e dopey sono anche fenotipicamente distinguibili (Coutinho et al.,2004)., In questi mutanti, la notocorda non riesce a differenziarsi, come misurato sia dall’espressione persistente di geni marcatori precoci, come il riccio di chidna, sia dalla mancata formazione di vacuoli normalmente gonfiati. Come nei mutanti laminina, la membrana basale non riesce a formarsi correttamente. A differenza dei mutanti laminina, tuttavia, a partire da circa 48 ore dopo la fecondazione mutanti sneezy, happy e dopey subiscono la morte cellulare diffusa per apoptosi e gli embrioni si disintegrano. Con la clonazione posizionale, abbiamo identificato che sneezy, happy e dopey codificano le proteine dello zebrafish α, β e β’ coatomer (Coutinho et al.,, 2004).

Sette subunità di coatomero, in combinazione con la piccola GTPasi Arf1, costituiscono il cappotto di vescicole COPI (Bannykh et al.,1998; Cosson e Letourneur,1997; Lowe e Kreis,1998; Nickel e Wieland, 1998). Nelle cellule eucariotiche, ci sono almeno tre vescicolarisistemi di rivestimento. Le vescicole rivestite di clatrina gestiscono l’endocitosi e le vescicole ricoperte di COPII mediano il trasporto del carico secretorio dal reticolo endoplasmatico al Golgi., Le vescicole COPI-rivestite sono pensate per essere largelyresponsible per il trasporto retrogrado degli enzimi all’interno del thatmaintain di Golgi la sua polarità e per il macchinario che trasporta le proteine dal theGolgi di nuovo al reticolo endoplasmatico ruvido (RER).

L’analisi al microscopio elettronico ha rivelato due importanti caratteristiche delle notocordcellule nei mutanti coatomeri del pesce zebra (Coutinho et al., 2004).In primo luogo, la via secretoria è bloccata, con conseguente accumuli massicci di materiali all’interno del RER, e la rottura dell’apparato di Golgi è evidente.,In secondo luogo, la membrana basale peri-notocordale non riesce a formarsi. Normalmente, la membrana basale peri-notocordale ha una struttura trilaminare(Fig. 5). Lo strato più vicino alla membrana plasmatica è un singolo, materiale scuro macchiato con apparenticrosslinks alla membrana plasmatica sottostante. Distale a questo strato è uno strato mediale di fibre orientate in una direzione attorno alla cellula notocorda, e distale a questo è uno strato esterno di fibre orientate in una direzione ortogonale. Nei mutanti coatomer, i due strati esterni non sono presenti, maè spesso osservato uno strato interno distinto., Colorazione con antibodysuggerisce laminina 1 che lo strato interno comprende in gran parte laminina. Utilizzando innesti dorsalorganiser di tessuto mutante in embrioni wild-type, e viceversa, l’origine embrionale dei due strati esterni di questa membrana basale è stato indagato. Sebbene simili esperimenti di innesto con mutanti della laminina abbiano dimostrato che la laminina potrebbe essere fornita dalla notocorda stessa o da fonti extranotocordali, gli innesti di tessuto mutante del coatomero mostrano che sia il fenotipo della membrana basale che quello della membrana basale sono autonomi rispetto alla notocorda., Pertanto, mentre lo strato interno ricco di laminina può essere fornito dai tessuti circostanti,è probabile che gli strati esterni della membrana basale peri-notocordale siano secreti dalle cellule notocordiche stesse.

La notocorda ha due caratteristiche, una membrana basale spessa e un vacuolo,entrambe le quali pongono una domanda insolita sulla via secretoria. Le proteine di coatomero sono essenziali per tutte le cellule e sia le proteine che gli MRNA di coatomero sono forniti automaticamente. Durante lo sviluppo wild-type, gli MRNA che codificano le proteine del coatomero sono espressi in chordamesoderm ad un livello elevato., Infatti, quando osservato da in situhybridisation, coatomer mRNA espressione sembra essere chordamesoderm-specificand ha un modello temporale e spaziale di espressione simile a geni comeflh. L’alto livello di espressione del coatomero nelcordamesoderma in via di sviluppo è probabilmente zigotico, e fornisce quindi una spiegazione del modo in cui le mutazioni in un gene essenziale per le cellule potrebbero portare a specifici difetti del primo sviluppo.

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