00:00:05.18 Nella prima lezione ho cercato di articolare per voi
00:00:08.02 perché la fosforilazione proteica è così fondamentale per la biologia.
00:00:11.25 Quello che mi piacerebbe fare qui è approfondire la struttura e la funzione della protein chinasi.
00:00:19.17 E se guardiamo a PKA, PKA è, ancora una volta, un prototipo di chinasi che comprendiamo meglio.
00:00:28.18 Ed è attivato dal neurotrasmettitore ormonale che si lega all’esterno di una cellula
00:00:37.00 in questo caso adrenalina. Ogni volta…l’adrenalina funziona come il glucagone.
00: 00:40 .,25E ogni volta che si secernono adrenalina nel flusso sanguigno
00: 00: 43.21 si sta attivando PKA e si sta legando ad un recettore G proteina accoppiata.
00:00:48.11 Stai attraversando una subunità G alfa e ti stai agganciando all’adenilato ciclasi,
00:00:53.08 che porta alla generazione di AMP ciclico.
00:00:56.12 E in questo caso, PKA, ancora una volta, è dormiente e si attiva quando
00:01:03.22 AMP ciclico si lega alle subunità regolatorie e quindi si scatena l’attività catalitica.
00:01:09.02 E ci sono molti substrati.
00:01:10.10 Quindi mi concentrerò qui sulla subunità catalitica., Come funziona come catalizzatore?
00:01:16.03 E la prossima volta parleremo di come è tenuto in questo stato dormiente dalle subunità regolatorie
00:01:21.25 e di come è mirato a siti specifici dalle proteine dello scaffold.
00:01:25.25 Ma, oggi voglio concentrarmi sulla chinasi.
00:01:28.07 Quindi, se torniamo a questa storia chinasi, abbiamo cominciato a trovare…
00:01:35.17 ci sono molte molte proteine chinasi e questo è venuto dalla clonazione di molte proteine diverse.
00:01:41.25 In modo da poter ottenere molto rapidamente la sequenza.
00: 01: 43.,24invece di fare questa sequenza nel modo più duro, facendo chimicamente quella sequenza.
00: 01: 49.15 E così la prima sequenza di proteine chinasi era PKA. Fu risolto da Tatoni nel 1981.
00:02:00.11 Ed è servito poi come un modello, come un quadro.
00:02:05.13 Abbiamo avuto…Ti ho detto che Src è stato clonato nel 1979, ma non è stato fino a quando PKA è stato sequenziato
00:02:11.03 che Margaret Dayhoff si rese conto che Src era correlato a PKA. Le due sequenze erano correlate.
00:02:18.12 Quindi è quello che li ha messi sullo stesso albero qui.
00:02:21.02 E poi nel 1991, abbiamo fatto la prima struttura di una proteina chinasi.
00: 02: 25 .,10E questo ci ha permesso di vedere le caratteristiche 3-dimensionali di questa famiglia di enzimi.
00:02:32.07 Quindi, lasciate che vi dica il tipo di informazioni che abbiamo raccolto da ciascuno di questi risultati.
00:02:40.04 Quindi ecco il kinome. Il cinoma si basa solo sull’analisi delle sequenze.
00:02:46.03 E la maggior parte dei genomi ora hanno circa il 2% del loro genoma è la codifica per le protein chinasi.
00:02:54.11 E le piante sono i vincitori. Hanno il 4%. Hanno la maggior parte delle protein chinasi.
00:02:59.04 Quindi è una delle più grandi famiglie di geni in ogni organismo eucariotico.
00:03:05.26 Se guardiamo la sequenza., Quindi cosa ci dice la sequenza?
00:03:10.07 Ci dice che…questa è una descrizione chimica della tua molecola.
00:03:15.10 Puoi vedere come da quella sequenza,
00:03:18.00 potremmo quindi immediatamente sapere che l’Src clonato è un omologo di PKA.
00:03:23.11 E poi potremmo fare cose chimiche; modifica con un analogo ATP, qui modificato lisina 72.
00:03:31.08 Che ci ha detto che questa lisina era vicino al sito attivo, vicino al sito di legame ATP.
00:03:36.06 E anche…in seguito abbiamo mostrato che si potrebbe
00: 03: 40.,25cross-collegarlo a due diversi residui di acido carbossilico, residui acidi.
00:03:47.07 Affinché tutti e tre questi residui, che sono distanti nella sequenza lineare,
00:03:52.00 devono essere vicini tra loro e vicino al sito attivo della proteina piegata.
00:03:57.07 E poi l’altra informazione qui è il sito di fosforilazione,
00:04:02.01 che è essenziale per l’attività e che è stato associato a questa particolare treonina.
00:04:10.02 Quindi queste sono le piccole informazioni che avevamo.
00:04:12.09 Potresti prendere quelle due chinasi,
00: 04: 16.,02una volta che sapevi che Src e PKA erano correlati e altre chinasi sono state clonate.
00:04:20.04 La scoperta iniziale fu da Margaret Dayhoff che Src e PKA erano correlati
00:04:25.10 e avevano molti residui conservati.
00:04:28.02 E poi Tony Hunter…Hanks e Hunter hanno fatto un’analisi dei sottodomini
00:04:35.13 e hanno chiarito questi vari sottodomini, ognuno con un motivo specifico.
00:04:39.09 E quei sottodomini hanno davvero resistito con il tempo come la definizione del nucleo protein chinasi.
00:04:47.20 Ma poi quando abbiamo avuto la struttura, ora si potrebbe cominciare a capire
00:04:52.,15come questi motivi si piegano insieme per formare una chinasi attiva.
00:04:57.09 Quindi ora puoi iniziare a mappare quella sequenza
00:05:03.22 in modo più completo su un framework strutturale.
00:05:07.18 Quindi qui mostriamo i due domini principali che sono conservati nella famiglia delle chinasi.
00:05:12.17 Uno, il piccolo lobo, è per lo più associato al legame ATP.
00: 05: 16.12 Quello grande ha molti residui associati al legame peptidico e alla catalisi.
00:05:21.28 Questi sono i residui conservati e potete vedere che sono sparsi su tutto il nucleo della chinasi.
00: 05: 27 .,02ha anche questo sito di fosforilazione qui. Questo è essenziale per la sua attività.
00:05:33.01 E un altro sito di fosforilazione qui al C-terminus, fuori dal nucleo.
00:05:37.18 OK, quindi questo è il lobo N e questo è il lobo C.
00:05:41.26 OK, quindi ora possiamo avere una comprensione più approfondita di quei motivi.
00:05:48.09 E questo è ciò che ora sappiamo è il nucleo conservato che è condiviso da tutte quelle proteine su quell’albero del cinoma.
00:05:56.25 Tutti hanno questo elemento comune a loro.
00:06:02.09 OK, quindi se guardiamo diversi esempi,
00: 06: 05.,27 Ti ho mostrato PKA, prima ho parlato di Src qui con i suoi domini SH3 e SH2.
00:06:13.15 Queste sono solo alcune altre chinasi. E si può vedere PKA è in realtà una specie di insolito
00: 06: 19.06 in quanto ha un relativamente small…it ha piccole code a ciascuna estremità, ma è per lo più
00: 06: 26.04 il dominio della chinasi e la sua parte normativa è una subunità separata-la subunità normativa.
00:06:33.00 Mentre altre chinasi hanno domini fusi: C1 e C2 collegati a PKC.
00:06:37.21 Si legano al calcio e al diacil-glicerolo.
00: 06: 41.,01ciclico GMP protein chinasi, molto simile a PKA, solo che è ciclico GMP vincolante domini sono fusi al nucleo chinasi.
00:06:48.12 Quindi ci sono tutti quelli che hanno in comune il nucleo della chinasi ma ognuno ha queste variazioni.
00:06:54.18 Quindi ora, di nuovo, se torni al nucleo,
00:06:58.23 puoi effettivamente mappare quei sottodomini sul nucleo della chinasi.
00:07:03.22 E così ho intenzione di mostrarvi, di nuovo, come questi ora correlano con il lobo N e C-lobo.
00:07:10.20 E dirvi un po ‘ di più sui due lobi pure.
00: 07:13 .,14Ecco ora la sequenza di PKA in cui possiamo mappare la struttura secondaria;
00:07:20.00 un’elica contro un filamento beta. Puoi mapparlo su quei sottodomini
00:07:24.22 e avere un contesto 3-dimensionale per quei sottodomini.
00:07:30.12 Quindi ecco quei sottodomini mappati sul nucleo di PKA e di nuovo codificati a colori.
00:07:38.14 Così puoi vedere i sottodomini che comprendono ciascuno di questi lobi, l’intero nucleo conservato.
00:07:47.06 E, Ho intenzione di camminare attraverso questi molto rapidamente
00:07:50.09 solo per mostrare alcune informazioni su questi.
00:07:54.25 Quindi, questo è il primo su., Sottodominio I è quello che chiamiamo il ciclo ricco di gylcine.
00:08:00.03 E qui puoi vedere il ciclo ricco di gylcine qui.
00:08:03.21 Puoi vedere le 3 gylcines che sono conservate nella maggior parte delle chinasi in alto.
00:08:08.21 E le caratteristiche si può cominciare a risolvere quali sono le caratteristiche che questo motivo fa.
00:08:15.01 E poi questo è seguito dal sottodominio II.
00:08:18.10 Ecco quella lisina, quella K. Questa è la lisina che viene modificata dall’analogo ATP.
00:08:24.02 Questa è la C-helix. Questo è solo elemento elicoidale che si trova nel piccolo lobo.
00:08:32.08 E poi hai un altro filamento beta.,
00:08:37.07 E poi hai questo sottodominio V che collega effettivamente i due domini.
00:08:43.12 Questo filamento beta è nel lobo N e questa elica è nel lobo C.
00:08:49.25 E questo piccolo pezzo che li unisce è il linker che unisce i due lobi.
00:08:55.09 E poi la E-helix. Questa è un’elica molto idrofoba.
00:09:00.01 E il circuito catalitico.
00:09:02.11 Questo sarà essenziale per la catalisi. E’un piccolo foglio beta nel lobo C.
00:09:09.04 E questa è un’altra parte di quel foglio beta. Questo è il ciclo di attivazione.
00: 09: 15 .,14E quindi parlerò di questi in modo più dettagliato.
00:09:18.03 Questa è la F-helix very molto, molto importante. Questa intera molecola è organizzata attorno a questa F-elica.
00:09:25.05 È insolito in quanto passa proprio attraverso il centro del lobo C.
00:09:29.20 E ‘ molto idrofobo. Basta analizzarlo si potrebbe pensare che fosse un’elica di membrana-spanning.
00:09:35.04 Estremamente idrofobo.
00:09:37.14 E poi questo G-elica serve come un sito di attracco per le proteine e H-elica.
00:09:42.10 E qui solo per mostrarti un esempio che confronta i sottodomini di PKA e Src,
00:09:48.,10puoi vedere che ci sono piccole differenze ma nel complesso, quei sottodomini sono conservati.
00:09:53.10 La piega è conservata in tutte quelle protein chinasi, tutte quelle 500.
00:09:58.28 Quindi, ti parlerò prima di questi lobi
00:10:02.06 perché penso che ti darà una comprensione di come questi sottodomini lavorano insieme
00:10:07.02 sinergicamente per creare una chinasi attiva.
00:10:10.00 E quindi questo è l’N-lobo e contiene questo ciclo ricco di glicina
00:10:15.02 di cui ti ho parlato. Quelle sono le tre glicine.
00: 10: 17.,16e poi l’elica C è l’altra caratteristica veramente conservata qui.
00:10:22.09 E si può vedere la lisina 72 e Glu91.
00:10:26.03 Questi sono i residui che sono stati collegati tra loro dai nostri studi chimici.
00:10:30.14 Quindi, quando abbiamo visto questa struttura, la mia prima cosa è stata dire,
00:10:34.07″Dov’è quella lisina? E dove sono quei residui che si collegano ad esso?”
00:10:37.19 Ed è stato…erano tutti a posto uno accanto all’altro proprio come pensavamo dagli studi chimici.
00:10:43.17 Ma non siamo riusciti a capire come si relazionavano tra loro fino a quando non abbiamo visto quella struttura.,
00:10:49.04 OK, quindi il ciclo di glicina è la parte più mobile della chinasi.
00:10:58.18 E deve aprire e chiudere.
00:11:01.08 E quando si chiude si inserisce in cima al fosfato gamma di ATP
00:11:05.28 e lo posiziona per essere trasferito su un substrato proteico.
00:11:11.08 Quindi questa apertura e chiusura del ciclo di glicina è essenziale per la catalisi.
00: 11: 16.01 E quel legame idrogeno lì tra il ciclo glicina e il fosfato gamma di ATP è fondamentale.
00:11:26.22 Ora andiamo al lobo grande.
00: 11: 28.,17 Quindi è per lo più elicoidale ma ha questo foglio beta che è proprio nella fessura del sito attivo.
00:11:33.20 E alcuni di questi residui conservati si trovano qui in questi due anelli
00:11:39.18 e quelli sono molto essenziali per il trasferimento di quel fosfato.
00:11:42.29 E che si trova in cima a questo sottodominio elicoidale molto stabile.
00:11:48.03 Il lobo N è molto malleabile. Questo lobo è molto, molto stabile.
00:11:53.00 E alcune caratteristiche chiave che il fosfato che è importante per attivare la chinasi
00: 11: 59.16 è qui, e quando fosforilate quel sito, il sito attivo è al massimo attivo.,
00: 12: 10.10 Senza quel fosfato non è attivo.
00:12:12.09 Quindi, anche se è 20 angstrom di distanza dal sito attivo, è essenziale per creare la chinasi attiva.
00:12:18.15 E senza quella fosforilazione, l’enzima si svolge davvero molto facilmente
00:12:23.16 e le sue proprietà chimiche sono tranquille diverse.
00: 12: 27.02 Un fosfato, solo un fosfato.
00:12:30.02 Questo è il ciclo catalitico. Molti dei residui catalitici che sono importanti.
00: 12: 34.07 Questo P+1 loop è importante da docking peptide substrati.
00: 12: 40.,11così, se guardiamo una mimica di quello che pensiamo potrebbe essere uno stato di transizione per il trasferimento del fosfato,
00:12:47.06 questo è il…il fluoruro di alluminio funge da mimico per il fosfato gamma di ATP
00: 12:54.19 e si hanno i residui dal ciclo catalitico nel lobo C,
00:12: 58.17 i residui dal ciclo ricco di glicina nel lobo N.
00:13:01.15 Convergono su quel fosfato gamma e lo trasferiscono al substrato peptidico.
00:13:06.17 Quindi, molto bella chimica di come questi si uniscono al sito attivo.
00:13:12.05 Quindi diamo un’occhiata, per un momento, alla catalisi.,
00:13:15.03 Quindi, la chinasi deve aprirsi e chiudersi come parte del suo ciclo catalitico.
00:13:20.19 Quindi, quando è aperto, è in realtà tranquillo malleabile.
00:13:24.28 Quindi, lega ATP e i suoi substrati peptidici e qui, per quel momento transitorio di catalisi,
00:13:32.05 è in una conformazione chiusa.
00:13:34.08 Quindi, se guardiamo come questi appaiono nella molecola, questa è la conformazione aperta a sinistra
00:13:44.20 dove hai un buco lì, è dove l’ATP sta per inserirsi in quel grande buco.
00: 13: 48.,19e poi la conformazione chiusa, si può vedere come quella fenditura sito attivo veramente scende e si chiude.
00:13:55.09 E ora, in questo…questo ti darà solo un’immagine di come questa chinasi si apre e si chiude.
00:14:01.19 E sta trasformando gli stati aperti e chiusi.
00:14:03.24 E sto solo andando a sottolineare, prima di vedere il film, la lisina 72 e la Glu91.
00:14:09.22 Quelli erano due dei residui che reticolato.
00:14:11.24 Così ora è possibile ottenere un senso di come apertura e chiusura del sito attivo schisi sta avvenendo.
00: 14: 21.,11E quindi questo è solo un morphing conform la conformazione aperta e la conformazione chiusa,
00:14:25.25 essenzialmente la respirazione di una molecola di proteina chinasi.
00:14:30.21 OK, quindi se guardiamo da vicino ora a quella conformazione chiusa in cui l’ATP è legato,
00:14:37.06 puoi vedere che la maggior parte dell’ATP è sepolta in quel buco profondo lì.
00:14:40.22 E solo il piccolo fosfato gamma sporge sul bordo dell’interfaccia
00:14:46.12 tra il ciclo ricco di glicina dal lobo N e il ciclo catalitico dal lobo grande.
00: 14: 53.00 E poi si può vedere qui come un peptide si inserisce in quel sito.,
00:14:57.01 Così, si banchina principalmente sul grande lobo.
00:15:00.27 Ecco il residuo P+1. E ‘ una bella, in questo caso, tasca idrofobo
00:15:04.20 dove quel residuo idrofobo banchine.
00:15:07.29 Questo è uno pseudo-substrato. E ‘ un’alanina invece di una serina.
00:15:11.06 Se fosse una serina accetterebbe il fosfato e trasferirebbe il fosfato.
00:15:16.08 E poi, PKA ama residui di base e quindi hai residui acidi sulla proteina in rosso
00:15:23.06 che riconoscono quegli amminoacidi di base nel peptide.
00: 15: 26.,09e poi per il peptide inibitore che è legato in…ciò è un peptide legante molto di alta affinità.
00:15:35.17 Ha un’elica che attracca al sito attivo schisi e questo serve come un sito di tethering.
00:15:45.08 Quindi ti ho detto come funziona PKA. È la chinasi che comprendiamo meglio in termini di struttura e funzione.
00:15:53.10 Ma ora abbiamo tutto questo albero kinome.
00:15:55.22 E, cosa possiamo imparare ora da una famiglia numerosa?
00: 16: 02.15 Abbiamo…poiché questi sono così importanti per le malattie, abbiamo molte strutture chinasiche.
00: 16: 07 .,17cinasi sono diventati un obiettivo importante per la scoperta di farmaci. Quindi abbiamo molte chinasi.
00:16:12.22 Quindi ti ho mostrato cosa possiamo imparare da un’analisi approfondita di una chinasi.
00:16:18.13 Cosa possiamo imparare da questo kinome strutturale ora dove hai
00:16:22.26 non solo molte sequenze ma hai molte strutture?
00:16:26.16 E, possiamo imparare diversi tipi di cose.
00:16:28.28 Ho intenzione di dirvi alcune lezioni globali che possiamo imparare su tutta la famiglia.
00:16:32.10 Si può approfondire in una sola famiglia
00:16:35.,05e scoprire quali sono le caratteristiche uniche di una sottofamiglia contro un altro.
00:16:39.27 Quindi questa è solo sei delle diverse strutture di chinasi, nuclei di chinasi.
00:16:47.25 E puoi vedere che i sottodomini sono per lo più conservati in tutte queste chinasi.
00:16:53.22 Cosa possiamo imparare da quel cinoma strutturale?
00:16:59.04 Una delle cose che abbiamo fatto è stato quello di sviluppare un metodo che chiamiamo allineamento modello spaziale locale.
00:17:07.01 E questo è solo rapidamente confrontando due strutture e guardando i residui spazialmente simili.
00: 17: 15.09 E questo vi fornisce un modello.,
00:17:18.05 Puoi farlo indipendentemente da qualsiasi allineamento di sequenza.
00:17:20.25 Solo due strutture, confrontarle.
00:17:23.07 E si ottengono figure come questa che mostra la relazione spaziale dei residui in due protein chinasi.
00:17:34.00 E così se guardiamo qui si può vedere un paio di residui chiave
00:17:38.09 che questi bordi indicano un legame spaziale tra due aminoacidi.
00:17:46.23 E più bordi vanno a un particolare amminoacido, maggiore è il suo punteggio di coinvolgimento.
00:17:52.15 Lo chiamiamo un punteggio di coinvolgimento.
00: 17: 54.,24così creiamo una rete di residui correlati spaziali in due protein chinasi.
00:18:01.24 E questo è chiamato il punteggio di coinvolgimento. Più alto è il punteggio di coinvolgimento,
00: 18: 05.15 gli aminoacidi più spazialmente correlati interagiscono con quel particolare amminoacido.
00:18:12.24 Quindi usiamo questo primo per confrontare le chinasi attive e inattive.
00:18:20.04 Che cosa è diverso?
00:18:21.06 Riesci a trovare differenze spaziali che sono uniche per
00:18:28.01 la chinasi attiva e che non ci sono nella chinasi inattiva?
00:18:31.06 E da questa analisi abbiamo definito ciò che chiamiamo una colonna vertebrale.,
00:18:38.06 Successivamente l’abbiamo chiamata spina dorsale regolatrice
00:18:42.00 È una spina dorsale idrofoba che è conservata spazialmente in ogni chinasi attiva
00:18:47.12 e si rompe quando la chinasi è inattiva.
00:18:50.22 Ed è costituito da residui idrofobici.
00:18:53.02 Provengono da residui non contigui. Quindi uno viene da beta-4, uno è da alpha-C,
00:18:59.16 uno è dal motivo DFG, uno è dal motivo HRD, due sono nel lobo N, due sono nel lobo C.
00:19:08.14 E si allineano per rendere questa colonna vertebrale idrofobica.
00: 19: 12.,00Non lo troveresti mai per confronti di sequenza
00:19:15.11 perché, per analisi di sequenza, sono non contigui
00:19:17.26 ma sono spazialmente ben definiti come un motivo conservato.
00:19:25.20 Quindi siamo tornati indietro e abbiamo guardato tutte le chinasi
00:19:29.00 e abbiamo scoperto che c’erano in realtà due spine.
00:19:34.03 E così abbiamo trovato una seconda spina dorsale, che chiamiamo la spina dorsale catalitica, oltre alla spina dorsale regolatoria.
00: 19: 40.22 E l’importanza di…ancora una volta, sono residui idrofobici che provengono sia dal lobo N che dal lobo C.
00: 19: 48.,04la cosa unica della colonna vertebrale catalitica è che è l’anello adenina di ATP che
00:19:52.19 completa la colonna vertebrale e collega i due.
00:19:54.26 Ciò significa che una volta aggiunto ATP, ora hai una nuova coordinazione tra il lobo N e il lobo C.
00:20:04.02 Quindi l’altra caratteristica che è venuta da questa analisi è questa F-helix.
00:20:08.09 Questa è un’elica molto idrofoba che attraversa il lobo C.
00:20:12.06 Questo è molto insolito per una proteina globulare come una chinasi.
00:20:17.02 Ma, è molto altamente conservato e serve come il quadro…
00: 20: 22.,22è collegato sia alla colonna vertebrale regolatoria che alla colonna vertebrale catalitica
00: 20: 29.05 e it nucleates…it fornisce davvero l’architettura su cui si assembla una chinasi attiva.
00:20:36.27 E lo chiamiamo il motivo S2H o due spine e un’elica.
00: 20: 41.19 E che è davvero l’architettura fondamentale che ogni proteina chinasi.
00:20:46.21 Quindi, qui vi mostro solo che F-helix.
00:20:49.12 Puoi vedere come passa proprio attraverso il centro di questo lobo C.
00:20:55.02 Non si sarebbe mai prevedere che questo faceva parte di una proteina globulare da analisi di sequenza.
00: 21: 01.,10e puoi vedere, mentre questo ruota intorno, la relazione di quell’elica F con il resto della proteina.
00:21:13.06 Davvero…tutto è nucleato attorno a quell’elica F.
00:21:16.25 Puoi vedere alcuni dei residui chiave che emergono
00:21:20.29 che saranno importanti per il collegamento alle due spine che stanno uscendo da quell’elica F.
00:21:26.26 Lì puoi vedere le due spine,
00:21:28.04 come queste due spine siano realmente ancorate in modo molto fondamentale all’elica F
00: 21: 33.10 e al ciclo catalitico. Tutti gli elementi funzionali sono realmente legati a questa F helix.,
00:21:44.12 Quindi, di nuovo, puoi vedere qui, quando apri e chiudi la chinasi,
00:21:48.22 quelle conformazioni…puoi vedere che le due spine rimangono intatte come parte di quel movimento respiratorio.
00:21:55.10 Non interferisce con il movimento respiratorio della chinasi.
00:22:02.03 Quindi, ti darò un esempio qui del…questo è il recettore dell’insulina,
00: 22: 06.15 un altro membro di quel ramo della tirosina chinasi.
00:22:11.03 E questa è la conformazione attiva del recettore dell’insulina e si può vedere che
00:22:15.00 le due spine sono intatte., Questa è una conformazione completamente attiva della chinasi del recettore dell’insulina.
00:22:20.27 Quando non è attivo (ed è attivato dalla fosforilazione del suo ciclo di attivazione qui),
00:22:28.06 quando non è fosforilato sul suo ciclo di attivazione,
00:22:31.13 allora puoi vedere la colonna vertebrale rotta.
00: 22: 33.25 E questo è un modo in cui può essere rotto.
00:22:37.28 In realtà, un residuo della colonna vertebrale regolatrice va oltre e riempie la tasca adenina
00:22:43.07 per la colonna vertebrale catalitica.
00:22:44.10 Ma ci sono molte, molte variazioni di come si può rompere quella spina dorsale.
00: 22: 49.,20così, perché il fosfato è così importante?
00:22:53.00 Ho parlato di questo fosfato di essere davvero importante.
00:22:58.08 È importante per il recettore dell’insulina. È importante per PKA.
00: 23: 02.04 Che fosfato sul ciclo di attivazione…
00:23:04.22 E sto solo andando a mostrarvi: Ecco un fosfato in PKA
00:23:08.22 e sta facendo sette diverse interazioni elettrostatiche o legame idrogeno
00:23:17.10 con diversi residui catena laterale.
00:23:20.09 Ed è un sito di fosforilazione così integrato.
00: 23: 24.,19viene a questa istidina che è nell’elica C, nel sottodominio 3.
00:23:30.10 Va a lisina 189 che è in realtà in beta-strand 9.
00:23: 37.26 Va a arginina 165 che proprio prima del ciclo catalitico.
00: 23: 44.26 E integra tutto questo ciclo di attivazione.
00:23:48.24 Quindi, sta giocando un ruolo fondamentale nell’integrazione di tutti i sottodomini della proteina.
00:23:56.18 Quindi in quest’ultima parte volevo tornare alle chinasi e alle malattie
00:24:00.07 e ancora, riferirmi a ciò che ti ho detto su questi sottodomini e le spine.
00: 24: 08 .,25CI sono probabilmente più ora, ma almeno il 30% delle chinasi sono implicate in varie malattie
00:24:13.28 e questo sta crescendo continuamente mentre approfondiamo più profondamente le diverse chinasi.
00:24:20.08 Molti altri sono suscettibili di seguire come otteniamo sempre più informazioni genomiche
00:24:24.21 e correlazioni di malattia.
00:24:28.10 Le chinasi sono trattabili come bersagli farmacologici perché puoi inibirle e
00: 24: 34.00 ti mostrerò un esempio di questo.
00:24:36.01 Quindi questo è il chinoma umano e ti sto mostrando una chinasi nel ramo della tirosina lì.
00: 24: 42.,28questo è Abl, un parente di Src.
00:24:46.07 E in questa malattia fatale leucemia mylogenous cronica
00:24:51.23 è questo Abl che viene modificato. È fuso con un’altra proteina e lo rende un oncogene.
00:24:56.27 Quindi, è costitutivamente attivo. E ‘ sempre acceso.
00:24:59.23 Questo è ciò che rende un oncogene–non puoi spegnerlo.
00:25:03.03 Quindi, questo Gleevec è stato scoperto come un inibitore molto specifico di BCR-Abl.
00:25:12.07 E questa è la vera prova di principio che dice che le chinasi sono bersagli farmacologici molto trattabili.
00: 25: 23.,07Se guardiamo l’Abl con ATP legato ad esso potete vedere qui le due spine;
00: 25: 28.09 la spina regolatoria, la spina catalitica. Questo è Abl attivo.
00:25:32.16 E poi lo si confronta ora con la struttura in cui Gleevec è legato
00:25:37.17 e questo è stato fatto dal laboratorio di John Kuriyan.
00:25:42.04 È legato alla fessura del sito attivo, ma puoi vedere quando Gleevec si lega,
00:25:46.22 la spina dorsale regolatrice è rotta e quindi sta effettivamente tessendo attraverso
00:25:52.07 sia la spina dorsale catalitica che la spina dorsale regolatrice.
00:25:57.10 Quindi si lega a una conformazione inattiva
00:25:59.,12e puoi vedere con precisione le caratteristiche che vengono sfruttate da Gleevec.
00:26:05.03 Quindi, uno dei siti che è frequentemente associato alla resistenza a Gleevec
00:26:11.20 è una mutazione di questo residuo di treonina nella tasca di legame ATP qui.
00:26:17.10 Quindi questo treonina è talvolta indicato come il gatekeeper.
00:26:20.04 E penso che nella diapositiva precedente…ecco il residuo del guardiano.
00:26:25.09 Vi mostro dove il residuo gatekeeper è.
00:26:27.09 È una treonina. E quindi la mutazione che avviene spesso è che viene convertita in metionina.,
00:26:33.10 Quindi la treonina è un piccolo residuo. La metionina è un residuo molto più ingombrante.
00:26:37.24 È così ingombrante che impedirà a Gleevec di legarsi.
00:26:41.15 È un ostacolo sterico, quindi lo blocca.
00:26:43.19, Ma fa di più e questo recente studio Daley e Kuriyan mostra che
00:26:51.07 quando si ha la metionina, piuttosto che la treonina,
00:26:55.08 la metionina è un bel residui idrofobici e colma una lacuna tra
00:27:01.22 il catalizzatore e la regolamentazione della colonna vertebrale e ciò che fa è che ora crea molto stabile e attiva della colonna vertebrale.
00: 27: 08 .,06così cambiando quel residuo, treonina, in un’isoleucina (metionina),
00:27:13.17 non solo abolisci il legame di Gleevec, crei anche un oncogene.
00:27:19.03 Ora hai stabilizzato questa colonna vertebrale regolatrice in un modo che non richiede più la fosforilazione.
00:27:26.01 Quindi questo non è solo resistente a Gleevec, questa proteina è un oncogene.
00:27:35.06 Quindi, ho parlato dei sottodomini e di come sono conservati in famiglia
00:27:39.26 e ti ho dato un apprezzamento di come funzionano le chinasi
00:27:42.,24 perché sono una destinazione trattabili per la scoperta della droga
00:27:46.18 e poi, cosa di cui voglio parlare la prossima volta è come la chinasi regolano
00:27:51.23 e per davvero, non stiamo andando a essere così interessati a macchine catalitiche,
00:27:56.01 abbiamo intenzione di essere davvero interessati, le superfici del chinasi
00:27:59.18, e come si fa PKA, in particolare, si legano ad altre proteine.
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