Non esiste ancora una cura per la fibrosi cistica. Nonostante i trattamenti migliorati che allungano la durata della vita del paziente, un paziente CF nato tra 2013-17 nel Regno Unito ha un’aspettativa di vita media inferiore a 50. Nel Regno Unito, circa 10.500 persone hanno la fibrosi cistica, secondo il Cystic Fibrosis Trust. Tra il 60-80% delle persone con fibrosi cistica soffrono di infezioni respiratorie croniche, comunemente causate da batteri Pseudomonas aeruginosa o Staphylococcus aureus., Una volta che i polmoni sono infettati, i batteri si differenziano rapidamente in sotto-ceppi, sviluppano resistenza agli antibiotici e diventano difficili da trattare. Attuali strategie di trattamento antibiotico sono equivalenti a nuking l’intero sito dall’orbita con una batteria di farmaci, un approccio che provoca gravi effetti collaterali, e in molti casi i batteri persistono.

L’infezione polmonare cronica danneggia le superfici delle cellule epiteliali e porta all’infiammazione, compromettendo la capacità del polmone di funzionare. Si stima che oltre l ‘ 80% dei pazienti affetti da fibrosi cistica venga ucciso da questi tipi di infezioni polmonari croniche., Ci sono molte cose che non capiamo su come questi batteri colonizzano e si diffondono nei polmoni e su come le interazioni batteri–batteri influenzano la loro sensibilità agli antibiotici.

Fortunatamente, gli scienziati stanno trovando nuovi modi per modello batterica comportamento nei polmoni infetti e ottenere indicazioni infezioni e resistere ai trattamenti., Questi risultati hanno il potenziale per aiutare i pazienti CF a vivere una vita più lunga e più sana.

La fibrosi cistica è causata da mutazioni nel gene del regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) che influenzano la produzione della proteina CFTR. Questa proteina forma canali ionici nelle membrane cellulari in tutto il corpo che regolano il flusso di ioni e molecole d’acqua dentro e fuori delle cellule. Quando la proteina CFTR non viene prodotta correttamente la sua capacità di trasportare ioni è compromessa, influenzando l’equilibrio di ioni di sale e acqua all’interno e all’esterno della cellula., Questo squilibrio porta a muco denso e appiccicoso nei polmoni, nel pancreas e in altri organi. Il muco tossito dal tratto respiratorio è chiamato espettorato.

Il muco che non si schiarisce è un terreno fertile per i batteri e porta a queste infezioni polmonari croniche nei pazienti affetti da FC. È anche difficile per gli agenti terapeutici penetrare nel muco e sradicare i batteri.

Quanti bug?

Il primo passo nella comprensione delle infezioni batteriche è quello di quantificare cosa sta succedendo., Il NIH Common Fund Human Microbiome Project (HMP) è stato istituito nel 2008 per caratterizzare il microbiota umano sano e indagare il loro ruolo nella malattia. La prima fase del progetto ha caratterizzato i microbiomi orali, intestinali e cutanei, ma non ha studiato i polmoni. La coltura di campioni polmonari su una capsula di petri – il modo tradizionale di identificare i batteri-non ha mostrato nulla, quindi gli scienziati hanno concluso che i polmoni sani erano sterili. Successive ricerche con tecniche di sequenziamento più avanzate hanno dimostrato che in realtà più specie di batteri abitano polmoni sani.,

Tuttavia, le differenze tra un microbioma polmonare sano e malsano sono “un’area piuttosto controversa in questo momento”, spiega Ann Field, senior director of drug discovery presso la Cystic Fibrosis Foundation, un’organizzazione no-profit statunitense. Alcuni studi identificano elenchi di organismi che sembrano essere presenti nei polmoni dove non c’è un’infezione, ma altri studi hanno identificato una notevole sovrapposizione nei tipi e nelle quantità di organismi nei polmoni sani e infetti. “La giuria è ancora fuori se esiste un” microbioma polmonare sano”, ” dice Field.,

Il metodo più comune per la quantificazione dei batteri è con 16S RNA ribosomiale (rRNA) il sequenziamento del gene, dove PCR amplifica il 16S rRNA gene presente nel DNA raccolti da campioni di espettorato. Il gene rRNA 16S è presente in tutti i batteri e funge da codice a barre per diverse specie.,

Quando hanno condotto il sequenziamento del rRNA 16S sull’espettorato di 77 pazienti affetti da fibrosi cistica, i ricercatori della Emory University e del Georgia Institute of Technology, entrambi ad Atlanta, negli Stati Uniti, hanno scoperto che la presenza di Pseudomonas, Staphylococcus e Achromobacter in quantità significative è correlata alla ridotta funzionalità polmonare nei pazienti con FC, mentre l’aumento della diversità Tuttavia hanno anche trovato eccezioni a queste tendenze.

Ci sono alcuni inconvenienti nell’uso di metodi basati sul DNA per quantificare i batteri nei polmoni., Nei pazienti affetti da CF è presente molto DNA ospite e batterico nei campioni, ma le quantità di DNA potrebbero non rappresentare la composizione effettiva dei batteri presenti. “Il DNA batterico si accumula a velocità diverse con diverse stabilità; molti insetti nelle vie aeree producono DNASI piuttosto buone, quindi tendono a degradare il DNA intorno a loro. Mentre con agenti patogeni come Pseudomonas il DNA si accumula continuamente, ‘ dice Michael Surrette, professore di microbiologia presso la McMaster University in Ontario, Canada.

Surrette sostiene che un modo più accurato per quantificare i batteri è cercare l’RNA batterico., Lo svantaggio dei metodi di sequenziamento basati su RNA è anche se fornisce un’istantanea più accurata delle specie presenti, l’RNA non è stabile e ha un’emivita di minuti. Anche l’estrazione dell’RNA dall’espettorato è difficile. “L’espettorato è il peggior campione possibile con cui farlo”, dice Surette. Il suo gruppo ha sviluppato un protocollo che rompe le matrici saliva, stabilizza l’RNA prima di amplificazione e sequenziamento, e richiede meno di cinque minuti per eseguire.,

Resistenza agli antibiotici

Più del 50% degli adulti con CF negli Stati Uniti sono infetti da Pseudomonas, di cui circa un terzo è multiresistente. Pseudomonas è un agente patogeno opportunistico che infetta solo le persone con un sistema immunitario indebolito. Esistono molteplici percorsi meccanicistici attraverso i quali Pseudomonas acquisisce resistenza agli antibiotici. L’abitudine di Pseudomonas di formare biofilm protettivi aumenta la difficoltà di eradicazione.,

Per studiare la resistenza, il team di Steve Diggle del Georgia Institute of Technology ha sviluppato biofilm Pseudomonas su perline di plastica con mezzi di espettorato sintetico nel corso dei giorni 50. Hanno scoperto che entro un mese Pseudomonas aveva abbastanza mutazioni nel gene IasR-che promuove la creazione di proteine di virulenza – per ottenere tolleranza a diversi antibiotici beta-lattamici, anche quando i campioni non sono stati trattati con antibiotici.

Il laboratorio di Diggle ha anche mostrato che ceppi più aggressivi di Pseudomonas rilasciano piocine che uccidono i ceppi di Pseudomonas concorrenti., Questo assicura che i ceppi più virulenti – e mortali – vengano a dominare i polmoni del paziente CF.

io uso l’esempio di galassie nell’universo: c’è un sacco di loro, ma la maggior parte sono troppo distanti l’uno dall’altro per interagire

un Altro fattore di complicazione è che la presenza di più microbi del polmone può influenzare la loro capacità di resistere agli antibiotici., Un ceppo di batteri che è stato coltivato e purificato da un campione di paziente potrebbe mostrare sensibilità a un particolare antibiotico nel piatto, ma apparire resistente a tale trattamento nel contesto di un’infezione polimicrobica. “L’implicazione è che questi microbi interagiscono in qualche modo che cambia la loro biologia e fisiologia in modo tale da non essere sensibili all’antibiotico”, afferma George O’Toole, microbiologo del Dartmouth College nel New Hampshire, negli Stati Uniti.

Il laboratorio di O’Toole cerca le relazioni di cross-feeding all’interno delle comunità polimicrobiche., Il metabolita dei rifiuti di una specie batterica può essere cibo per un’altra. Utilizzando simulazioni al computer con una selezione nota di batteri e nutrienti preesistenti, il suo team può modellare lo scambio e l’accumulo di metaboliti nelle comunità polimicrobiche. Hanno scoperto che Pseudomonas spesso cresceva fino a diventare i batteri dominanti, ma la presenza di patogeni più rari che consumavano anche gli stessi metaboliti alimentari di Pseudomonas poteva impedirne la crescita. Come questi tipi di interazioni microbiche influenzano la sensibilità agli antibiotici non è ancora noto.,

Non tutti gli scienziati concordano sul fatto che esiste un microbioma polmonare in cui più microbi interagiscono tra loro. “Uso l’esempio delle galassie nell’universo: ce ne sono molte ma la maggior parte sono troppo distanti l’una dall’altra per interagire”, dice Diggle, che pensa che lo stesso potrebbe essere vero per le colonie batteriche nel polmone. Egli sostiene che vedere le interazioni tra due specie di batteri in un piatto non significa che normalmente interagiscono tra loro nel polmone.,

‘Essenzialmente ogni programma di scoperta di farmaci viene eseguito guardando la capacità di un antibiotico di trattare un singolo microbo in una coltura,’ dice O’Toole, che non vede che come un approccio efficace in CF quando quasi ogni paziente ha infezioni polimicrobiche. “Dobbiamo pensare a una pipeline di scoperta di farmaci in cui stai effettivamente cercando farmaci che siano efficaci nel contesto di un’infezione mista.’

Modellare i polmoni CF

Un’altra sfida quando si tratta di fibrosi cistica è modellare efficacemente la malattia e il microambiente all’interno dei polmoni malsani., I polmoni sono difficili da immaginare e analizzare quando sono ancora in uso. Quando l’espettorato viene tossito per l’analisi, i medici non sanno da quale parte dei polmoni provenga il campione o se si tratti di un mix di colonie batteriche da più posizioni. Senza modelli efficaci, gli scienziati non possono studiare efficacemente la malattia e sviluppare trattamenti migliori.

‘A differenza dei pazienti CF umani, i topi CF non riescono a sviluppare malattie polmonari spontanee o infezioni batteriche croniche., Anche i modelli di coltura cellulare 2D non comprendono molti dei meccanismi e delle risposte terapeutiche delle malattie respiratorie”, afferma Sean Murphy, bioingegnere presso Wake Forest Institute for Regenerative Medicine in South Carolina, Stati Uniti.

Eseguire esperimenti in tempo reale sui polmoni viventi è quasi impossibile, quindi alcuni ricercatori hanno creato organi miniaturizzati da studiare., I ricercatori dell’Università di Harvard nel Massachusetts, negli Stati Uniti, hanno trascorso molti anni a costruire dispositivi di organi-on-a-chip che imitano le condizioni fisiologiche. I loro chip di organi sono dispositivi di coltura microfluidica che hanno due canali paralleli cavi larghi meno di un millimetro. Sono separati da una membrana porosa rivestita con una matrice extracellulare per mediare l’adesione cellulare nel corpo e le azioni in vitro. “Hanno le dimensioni di una memory stick per computer, una piccola pen drive”, afferma Donald Ingber, direttore fondatore del Wyss Institute for Biologicamente Inspired Engineering di Harvard., I risultati sono viventi, sezioni trasversali 3D delle principali unità funzionali degli organi. Hanno chip polmonari individuali che stanno per gli alveoli, le sacche d’aria e le vie aeree.

Il progetto lung on-a-chip del Wyss Institute è iniziato nel 2018 con una sovvenzione della Fondazione per la fibrosi Cistica. Quando i ricercatori hanno messo le cellule endoteliali polmonari da pazienti CF su chip i mini organi hanno prodotto mucus più spessi e hanno avuto un movimento capillare anormale e una maggiore risposta infiammatoria. Ingber dice che useranno questi chip per decodificare il processo di malattia modificando le variabili fisiologiche.,

Ci sono speranze che i polmoni su un chip possano aiutare a spiegare il meccanismo dell’infiammazione polmonare CF. “Ci sono alcune prove che le risposte infiammatorie della FC sono esagerate o soppresse indipendentemente dalla malattia polmonare della FC”, osserva Murphy, anche se le infezioni batteriche croniche e i danni hanno anche un impatto significativo sulla risposta infiammatoria. Il suo team ha costruito il proprio sistema lungs-on-a-chip che può utilizzare diverse combinazioni di cellule immunitarie CF o non-CF e dell’epitelio per comprendere meglio i meccanismi di infiammazione nel polmone CF e il sistema immunitario.,

Modulatori

Nonostante molte domande senza risposta sulla biologia sottostante della malattia e le sue infezioni croniche di accompagnamento, il trattamento e la gestione della fibrosi cistica sta subendo un enorme cambiamento di paradigma con la recente introduzione di farmaci modulatori CFTR. Sono chiamati modulatori perché modulano la funzione della proteina CFTR in modo che possa servire alla sua funzione primaria: creare un canale per far fluire gli ioni cloruro attraverso la superficie cellulare.

Quando viene ripristinato il corretto flusso di cloruro, il muco viene reidratato all’interno dei polmoni e di altri organi., Anche se i farmaci modulatore corrente non ripristinano completamente il corretto flusso di cloruro, possono migliorare il flusso abbastanza per alleviare i sintomi per le persone con CF. Symkevi-un farmaco di Vertex Pharmaceuticals-è una combinazione di farmaci modulatori ivacaftor e tezacaftor è stato approvato a dicembre 2018 per l’uso nell’UE. Vertex ha seguito questo con Trikafta-un trattamento con un terzo modulatore farmaci elexacaftor – che è stato approvato dalla FDA nel mese di ottobre 2019. L’Agenzia europea per i medicinali sta ancora esaminando la domanda di autorizzazione e prenderà una decisione alla fine del 2020.,

Non possiamo permetterci di abbassare la guardia

Trikafta è approvato per i pazienti di età pari o superiore a 12 anni che hanno almeno una mutazione F508del nel gene CFTR, che è circa il 90% dei pazienti con fibrosi cistica. Negli studi clinici, le persone con due copie della mutazione F508del hanno avuto un aumento del 3,4% della funzionalità polmonare dopo l’assunzione di Symkevi rispetto al trattamento con il gruppo placebo. Le persone che hanno assunto Trifkafa hanno avuto un ulteriore aumento del 10% della funzionalità polmonare rispetto ai pazienti che assumevano Symkevi.,

Oltre ai modulatori esistono diverse classi di terapie mirate a diversi aspetti della proteina CFTR, anche se queste devono ancora essere approvate per un uso diffuso. I potenziatori sono modulatori CFTR che tengono aperto il cancello in modo che il cloruro possa fluire attraverso la membrana cellulare. I correttori aiutano la proteina CFTR a formare la giusta forma 3D in modo che sia in grado di trasportare ioni sulla superficie cellulare. Infine, gli amplificatori CFTR aumentano il numero di proteine CFTR sulla superficie cellulare. Se la cellula produce più proteine CFTR, aumenta il flusso di ioni cloruro attraverso la membrana cellulare., Gli amplificatori, che sono in fase di sviluppo e test, non sono ancora disponibili in commercio.

Nonostante l’ottimismo che circonda i risultati migliorati per i pazienti CF con l’arrivo di farmaci modulatore, Surrette ha avvertito che i modulatori possono portare a una nuova serie di problemi di infezione. Anche quando questi modulatori chiarire il muco nei polmoni adulti CF paziente, cicatrici da infezioni passate e riacutizzazioni rimarrà ancora, il che significa polmoni CF non sarà mai abbastanza guardare come polmoni sani., I ricercatori non sono sicuri se i pazienti con modulatori CFTR otterranno un microbioma polmonare permanentemente sano o se gli agenti patogeni alla fine torneranno. “Questo sarà un ambiente per potenziali nuovi agenti patogeni che non abbiamo mai visto prima. Non possiamo permetterci di abbassare la guardia,’ dice Surrette.

Claire Jarvis è una scrittrice scientifica con sede ad Atlanta, Stati Uniti