Il corretto assemblaggio e la funzione del fuso mitotico non sarebbero possibili senza la presenza di proteine motorie, che accoppiano l’energia dell’idrolisi di ATP per forzare la produzione. Gli studi in sistemi multipli, quali il lievito Saccharomyces cerevisiae e gli estratti delle cellule di HeLa hanno stabilito il concetto che le forze antagoniste dalle proteine multiple del motore sono essenziali per l’assemblea e la funzione del fuso (esaminate dentro )., Gli studi presentati da Sharp e colleghi forniscono una bella illustrazione di come si possono esaminare le forze antagoniste tra diverse proteine motorie nella mitosi in vivo utilizzando embrioni precoci della Drosophila melanogaster. Hanno focalizzato i loro studi su tre proteine motorie note per essere importanti per l’assemblaggio del mandrino nelle mosche: KLP61F, Ncd e dynein citoplasmatico. KLP61F è un KRP bipolare proposto per cross-link microtubuli anti-paralleli per generare forze di scorrimento nel fuso mitotico . Sharp e colleghi hanno esaminato la funzione di KLP61F mediante microiniezione di anticorpi nei primi D., embrioni melanogaster che erano stati precedentemente iniettati con tubulina fluorescentemente etichettata in modo che la mitosi potesse essere seguita con imaging time-lapse. L’inibizione di KLP61F ha provocato la separazione iniziale dei centrosomi che poi sono collassati di nuovo insieme dopo la ripartizione nucleare dell’involucro. Questi risultati suggeriscono la presenza di una forza antagonista che agisce contro KLP61F e con conseguente collasso del centrosoma. Sharp e colleghi hanno suggerito che questa forza opposta proviene probabilmente dal KRP Ncd, che collega anche i microtubuli e svolge un ruolo nell’assemblaggio del mandrino e nella segregazione cromosomica ., L’iniezione degli anticorpi di KLP61F negli embrioni ncd null D. melanogaster ha provocato i fusi anormali, ma il collasso del centrosoma non è mai stato osservato, suggerendo che KLP61F e Ncd forniscono le forze antagoniste per il posizionamento del centrosoma. Un altro motore importante nella funzione del mandrino è la dineina citoplasmatica. In D. melanogaster, la dineina citoplasmatica si trova localizzata nella corteccia. L’iniezione degli anticorpi inibitori della dynein o della dinamitina p50, che interrompe il complesso della dynein-dynactin, ha provocato l’inibizione di formazione del fuso bipolare., Sorprendentemente, l’inibizione sia di dynein che di Ncd ha provocato il ripristino dei fusi bipolari. Il modello di lavoro è che dynein agisce alla corteccia per tirare su microtubuli astrali, con conseguente forze che mantengono centrosomi a parte. Presi insieme, questi esperimenti di inibizione degli anticorpi rivelano la complessa integrazione della funzione motoria che agisce per mantenere la bipolarità del mandrino negli embrioni viventi.

La questione di ciò che guida l’assemblaggio del mandrino e genera la bipolarità del mandrino rimane un mistero., Una delle più sorprendenti scoperte recenti è che i mandrini bipolari possono essere assemblati in assenza di centrosomi, cinetocori o DNA. L’attivazione del piccolo GTPase Ran induce la formazione di microtubuli aster e l’assemblaggio del mandrino bipolare (rivisto in ). Wilde ha presentato il lavoro analizzando il meccanismo con cui questo potrebbe verificarsi. Wilde razionalizzato che Ran deve agire inducendo la formazione di microtubuli, o inducendo organizzazione microtubuli, o entrambi., Un argomento contro l’idea che Ran agisce esclusivamente inducendo la formazione di microtubuli è che gli agenti che stabilizzano i microtubuli, come il dimetilsolfossido (DMSO) o il taxolo, inducono la formazione di aster ma non la formazione del fuso bipolare quando aggiunto agli estratti di uova di Xenopus. Ma l’aggiunta di una versione dominante attiva di Ran agli astri indotti da taxol o DMSO assemblati in estratti stimola la formazione del fuso bipolare, favorendo l’idea che l’organizzazione dei microtubuli sia influenzata., Un’analisi dei movimenti dei semi di microtubuli stabilizzati sugli astri ha rivelato che Ran ha stimolato la motilità dei semi più diretti (le estremità dei microtubuli ” più ” si trovano alla periferia dell’aster), suggerendo che potrebbe essere attivato un motore più diretto. Wilde ha ipotizzato che Eg5, un KRP bipolare dimostrato in precedenza di essere importante nello stabilire bipolarità mandrino, potrebbe essere un obiettivo a valle di Ran. Infatti, l’inibizione di Eg5 ha ridotto la percentuale di semi che si muovono verso le estremità più dei microtubuli, rafforzando l’idea che Eg5 possa essere stimolato dopo l’aggiunta di Ran., L’idea che un motore richiesto per la bipolarità del mandrino sia stimolato da Ran ha senso nel capire come Ran potrebbe indurre la formazione del mandrino bipolare. Comprendere il meccanismo di questa stimolazione e identificare altri attori in questo processo saranno chiaramente aree importanti della ricerca futura.

Una volta assemblato un fuso bipolare, i cromosomi devono essere allineati alla piastra della metafase e quindi segregati durante l’anafase alle due cellule figlie., L’anafase è suddivisa funzionalmente in anafase A, quando i cromosomi si separano ma il fuso non cambia lunghezza, seguita dall’anafase B in cui i poli del fuso si separano l’uno dall’altro. Ci sono stati due meccanismi primari proposti per come i cromosomi possono essere spostati poleward in anafase A. Nelle cellule somatiche dei vertebrati, la depolimerizzazione dei microtubuli ai cinetocori rappresenta circa il 70-90% del movimento poleward, con la depolimerizzazione ai poli attraverso il flusso di microtubuli poleward che rappresenta il resto., Recenti esperimenti in mandrini assemblati in estratti di uova avevano suggerito che la maggior parte di anafase Un movimento avviene tramite depolimerizzazione dai poli dal flusso poleward . Questa è una proprietà unica dei mandrini assemblati con estratto o potrebbe essere un meccanismo generale per la segregazione cromosomica nei sistemi embrionali? Utilizzando microscopia fluorescente-macchiolina, Desai descritto trovando che il movimento cromosoma-polo in embrioni D. melanogaster si è verificato a 2 µm / min, la stessa velocità con cui subunità tubulina fluxed verso i poli ., Ciò suggerisce che la depolimerizzazione ai poli dovuta al flusso polare può essere la principale forza trainante per la segregazione cromosomica nei sistemi embrionali. Una ri-analisi del movimento cromosomico e del flusso nei mandrini assemblati negli estratti di Xenopus ha mostrato che il flusso si è verificato al 75% del tasso di movimento cromosoma-polo, suggerendo che una certa depolimerizzazione ai cinetocori deve avvenire nei mandrini assemblati con estratto. Desai e colleghi hanno anche iniziato a esplorare i meccanismi molecolari associati al flusso., L’inibizione del KRP microtubulo-depolimerizzante, XKCM1, non ha inibito il flusso di microtubuli poleward ma ha comportato un’inibizione della depolimerizzazione dei microtubuli ai poli, in modo tale che i microtubuli ai poli si curvassero intorno. Quando XKCM1 è stato inibito in combinazione con l’inibizione del KRP Eg5, il flusso di microtubuli si è praticamente fermato, suggerendo che queste due proteine potrebbero essere costituenti importanti del macchinario del flusso. Eg5 è l’omologo Xenopus della chinesina bipolare KLP61F; quindi sarebbe molto interessante eseguire esperimenti simili in D., melanogaster embrioni e stabilire se i due motori si comportano allo stesso modo in entrambi gli organismi.

In sintesi, il campo della mitosi sta facendo grandi progressi nello stabilire il meccanismo molecolare dell’assemblaggio del fuso mitotico e della segregazione cromosomica. L’importanza di questi processi per la sopravvivenza di ogni cellula e quindi dell’organismo stesso ha permesso l’evoluzione di un’intricata rete di giocatori e meccanismi sovrapposti per garantire la fedeltà., Un risultato sorprendente degli studi presentati alla riunione è che ci sono processi ridondanti in atto per ogni aspetto della mitosi e che più proteine correlate sono coinvolte in ogni fase. Ci deve essere una completa integrazione della funzione delle proteine coinvolte nella mitosi, comprese quelle che agiscono direttamente sul mandrino, come le proteine motorie, quelle che controllano le dinamiche di polimerizzazione dei microtubuli e quelle che coordinano la funzione del mandrino con il resto della cellula., Chiaramente la regolamentazione di questo complesso macchinario sarà un’area importante della ricerca futura, poiché andremo oltre l’identificazione di componenti proteici aggiuntivi e in un’era di analisi più meccanicistica.

Aspetti chiave della funzione mandrino.