Braz J Med Biol Res, February 2010, Volume 43(2) 206-210

An improved in vivo method for atrioventricular node ablation via thoracotomy

R.H. MacIver1, R.D. Stewart1, C.L. Backer1, S. Tsao2, D.A. Harrington1,3 and C., Cleveland, OH, USA

Abstract
Introduction
Material and Methods
Results
Discussion

Acknowledgments
Correspondence and Footnotes

Abstract

The atrioventricular (AV) node is permanently damaged in approximately 3% of congenital heart surgery operations, requiring implantation of a permanent pacemaker., I miglioramenti nella progettazione del pacemaker e nelle modalità di trattamento alternative richiedono un efficace modello in vivo di blocco cardiaco completo (CHB) prima che il test possa essere eseguito negli esseri umani. Tale modello dovrebbe consentire un’induzione accurata, affidabile e rilevabile della patologia chirurgica. Attraverso gli sforzi del nostro laboratorio nello sviluppo di una terapia di ingegneria tissutale per CHB, descriviamo qui un modello migliorato in vivo per indurre il blocco AV cronico. Il metodo impiega una toracotomia destra nel coniglio adulto, da cui l’appendice atriale destra può essere retratta per esporre un canale di accesso per il nodo AV., È stato progettato un nuovo dispositivo di iniezione, che limita fisicamente la profondità dell’ago e fornisce informazioni elettriche tramite l’interfaccia dell’elettrocardiogramma. Questa combinazione di funzionalità fornisce una guida in tempo reale al ricercatore per confermare il contatto con il nodo AV e documenta la sua ablazione dopo l’iniezione di formalina. Mentre tutti gli animali testati potevano essere indotti al blocco AV acuto, quelli con guida ECG avevano maggiori probabilità di mantenere il blocco cardiaco cronico > 12 h., Il nostro modello consente al ricercatore di riprodurre sia CHB che la fibrosi periferica associata che sarebbe presente in una cardiochirurgia congenita aperta e che avrebbe inevitabilmente un impatto sulla progettazione e sull’utilità di una sostituzione del nodo AV ingegnerizzato nel tessuto.,

parole Chiave: nodo Atrioventricolare; blocco Cardiaco; Ablazione); ingegneria dei Tessuti; medicina Rigenerativa; modello In vivo

Introduzione

atrioventricolare (AV) il nodo è parte integrante del sistema di conduzione cardiaca, che agisce sia come una stazione di rilancio e di una temporanea pausa per la stimolazione del segnale dal nodo seno-atriale. La sua delicata posizione all’interno del pavimento dell’atrio destro rende il nodo AV una vittima involontaria di procedure ricostruttive, con danni permanenti in circa il 3% delle operazioni di cardiochirurgia congenita (1)., Attualmente, l’unico trattamento per il blocco cardiaco AV di classe III è l’impianto di un pacemaker artificiale permanente. Mentre tali dispositivi hanno rivoluzionato la sopravvivenza del paziente e la qualità della vita, il loro uso implica una serie di questioni connesse, compresi la vita del dispositivo, paziente attivo consapevolezza in forti campi magnetici, la graduale riduzione di piombo conducibilità a causa di usura o la formazione della cicatrice sull’elettrodo, e, per la popolazione pediatrica, l’incapacità di un dispositivo artificiale per crescere con il bambino., I trattamenti futuri, come gli scaffold biodegradabili ingegnerizzati con tessuti, potrebbero affrontare con successo questi problemi, attraverso la biointegrazione nel tessuto esistente (2).

I ricercatori nella progettazione di pacemaker e modalità di trattamento alternative richiedono un efficace modello in vivo di blocco cardiaco AV prima che il test possa essere eseguito negli esseri umani. Diversi metodi di ablazione del nodo AV sono stati descritti in letteratura (3), tra cui ablazione elettrica, crio e chimica e/o taglio del tratto nodale AV., Il primo uso di un agente sclerosante chimico senza atriotomia per distruggere il nodo AV è stato riportato da Erlanger e Blackman nel 1909 (4). Hanno iniettato una miscela di iodio e alcol direttamente nell’area del nodo AV, con scarsi risultati per quanto riguarda il raggiungimento del blocco cardiaco completo (CHB). La tecnica è stata modificata con risultati migliori passando al 10% di formalina (5) e utilizzando un dispositivo di mappatura/iniezione bipolare (6)., Williams e Lambert (7) successivamente descritto una tecnica di creazione di blocco AV senza la necessità di una toracotomia utilizzando un catetere guidato da pressione, fluoroscopia e ECG per individuare il nodo AV. Molti studi utilizzano questo approccio basato sul catetere in quanto è meno stressante per l’animale, raggiunge un eccellente targeting del nodo AV e consente test fisiologici immediati piuttosto che dover attendere che l’animale si riprenda da una toracotomia.,

Materiale e metodi

Per i nostri esperimenti, abbiamo deliberatamente scelto di eseguire una toracotomia seguita da iniezione chimica nel nodo AV, poiché riteniamo che corrisponda più strettamente alle condizioni presenti nello stato patologico del blocco AV dopo l’intervento cardiaco. L’induzione del blocco AV tramite un catetere non creerebbe le aderenze periferiche e la cicatrice presenti dopo che il pericardio è stato aperto in una toracotomia., Questo è rilevante quando si verifica una potenziale terapia impiantata, poiché l’integrazione funzionale dell’innesto sarà significativamente influenzata dal tessuto cicatriziale circostante. L’utilizzo di una toracotomia evita anche gran parte del costo e della configurazione dell’approccio del catetere.

Abbiamo scelto di condurre i nostri esperimenti nel coniglio adulto, in quanto fornisce un accesso chirurgico maggiore rispetto al ratto, ma con costi ridotti rispetto al cane, alla pecora o al maiale., In particolare, anche il metodo di ablazione con catetere sarebbe difficile in questa specie, poiché gran parte delle apparecchiature convenzionali disponibili è adatta solo per uso umano e animale di grandi dimensioni.

Mentre questi punti affrontano gli aspetti pratici chirurgici del modello, il successo del metodo si basa principalmente sulla capacità del ricercatore di ottenere un accesso diretto e preciso al nodo AV, di fornire in modo affidabile piccoli volumi dell’agente di necrosi e di confermare definitivamente l’ablazione del tessuto del nodo AV., A tal fine, abbiamo impiegato un ago calibro 27, piegato a 90°, a 5 mm dalla punta, per l’iniezione (Figura 1A). Questa tecnica mantiene una profondità costante (come precedentemente applicato in altre specie (8,9) ma ancora da descrivere nel coniglio adulto) per assicurare la consegna in un luogo definito. I nostri esperimenti di fattibilità iniziali impiegavano aghi con lunghezze di inserimento più corte (3 mm) o angoli di erogazione alternativi (0°, 45°); tuttavia, abbiamo scoperto che i parametri di cui sopra di 5 mm e 90° erano ottimali per accedere alla scanalatura atriale e prevenire una sovrastima della posizione del nodo AV.,

Mentre l’adattamento dell’ago forniva una guida fisica per localizzare il sito di iniezione corretto, abbiamo anche cercato una conferma fisiologica. A tale scopo, un’estremità di un cavo di rame è stata fissata alla base dell’ago e l’altra estremità è stata collegata a un ECG. Dopo l’inserimento dell’ago nella scanalatura atriale e il contatto con il nodo AV, si forma un’onda H sull’ECG. Questa guida è stata utilizzata in ogni procedura di ablazione prima dell’iniezione., Senza questa conferma elettrica, le iniezioni multiple erano spesso necessarie per l’induzione iniziale di CHB; La conferma dell’onda H ha ridotto sostanzialmente questa necessità.

Un ultimo parametro rilevante era la scelta di un agente di necrosi. Precedenti rapporti nei conigli e in altre specie avevano indicato un’induzione riuscita di CHB attraverso l’uso di alcol isopropilico al 70 o al 100%. In contrasto con questi rapporti, abbiamo ottenuto risultati scarsi utilizzando questi agenti nei nostri primi studi di fattibilità e, successivamente, abbiamo scelto la formalina tamponata neutra al 10% (NBF) come iniettabile., NBF è facilmente disponibile in molti laboratori, ed è noto per indurre la morte cellulare veloce e completa. NBF è stato impiegato in tutte le prove riportate nella presente Comunicazione.

Con questi parametri in atto, abbiamo condotto una serie completa di esperimenti per confermare il metodo nei conigli adulti della Nuova Zelanda. Dopo l’approvazione interna del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (Children’s Memorial Research Center), gli 8 conigli femmine (peso medio 3,7 ± 0,27 kg) sono stati anestetizzati con 0.,5 mg/kg di acepromazina (Promace®, Fort Dodge Animal Health, USA), 40 mg/kg di ketamina (Vetalar®, Fort Dodge Animal Health) e 7 mg/kg di xilazina (Rompun®, Bayer Healthcare, LLC, USA) prima di essere intubato e posto su un ventilatore con 2% di isoflurano (Abbott Laboratories, USA), 1 L/min. Ogni animale è stato posto supino e inclinato a sinistra di 30° con la gamba anteriore destra estesa verso l’alto. L’area di interesse è stata rasata e tamponata accuratamente con betadine. Il torace è stato raggiunto attraverso una toracotomia destra di circa 4 cm di lunghezza al quinto spazio intercostale., Una tasca sottocutanea che si estende posteriormente ~2 x 2 cm è stata realizzata per ospitare un generatore di pacemaker Medtronic VVI (MicroMinex 8360®, Medtronic, USA). Il polmone è stato retratto con una garza umida 4 x 4. Evitando il nervo frenico, il pericardio è stato inserito e retratto con 6-0 suture Prolene alla parete toracica creando un pozzo. Un cavo epicardico è stato quindi fissato alla superficie del ventricolo destro con due suture di prolene 6-0. L’altra estremità del cavo del pacemaker è stata tirata attraverso un foro di 1 mm nel sesto spazio intercostale e infilata nella tasca sottocutanea.,

L’appendice atriale destra è stata retratta per esporre l’area del nodo AV per l’iniezione. La posizione del nodo AV è stata approssimata inserendo la punta dell “ago modificato nella scanalatura tra l” aorta e atrio destro e dirigendo la punta verso la cuspide del setto della valvola tricuspide. La posizione è stata confermata dall’identificazione di un’onda H, utilizzando l’ago-ECG sopra descritto. Iniezioni di 10% NBF sono state fatte in volumi 0.1-cc fino a quando il blocco AV è stato notato visivamente dalla contrazione atriale continua senza successiva contrazione ventricolare coordinata., Una volta preparato con successo, l’animale è stato immediatamente stimolato a 180 bpm, prima dal programmatore CareLink® 2090 (Medtronic), e poi dal pacemaker impiantato, con soglie impostate al doppio della velocità di cattura. Gli animali sono stati monitorati per la funzione del nodo AV postoperatorio riducendo la velocità del pacemaker al di sotto della velocità impostata di 180 bpm. Gli animali la cui frequenza cardiaca è scesa al di sotto di 180 bpm sono stati determinati per essere in blocco AV.

Dopo aver osservato CHB e avviato la stimolazione esterna, abbiamo aspettato 30 minuti per assicurare che fosse ottenuta l’ablazione permanente del nodo AV., È stato descritto il recupero involontario del nodo AV a causa di ablazione incompleta (3), e questo stesso problema è stato notato nei nostri esperimenti preliminari. Abbiamo osservato empiricamente che l’ablazione AV sarebbe mantenuta per il breve termine se la funzione non tornasse entro 30 min, e abbiamo usato questo valore per guidarci nel set completo di esperimenti. Dopo il successo della ritenzione di CHB, il torace è stato chiuso in strati di 4-0 vicryl e la pelle è stata chiusa con una sutura in nylon 5-0., Una siringa da 60 ml, attaccata a un tubo toracico, è stata utilizzata per evacuare la cavità toracica circostante mentre ogni animale si riprendeva dall’anestesia. Enrofloxacina (5 mg / kg; Baytril®, Bayer Healthcare) è stato somministrato per prevenire l’infezione e 0,05 mg/kg buprenorfina cloridrato (Buprenex®, Webster Veterinary, USA) è stato somministrato come necessario per il dolore nelle prime 24 h. Qualsiasi segno di disagio incontrollato nell’animale durante il monitoraggio quotidiano ha portato all’eutanasia umana dell’animale.,

Risultati

Abbiamo definito cardiaca acuta blocco CHB mantenuta per 30 min dopo l’iniezione, mentre cardiaca cronica blocco è stato definito come CHB mantenuto per 12 ore. Per l’uso a lungo termine come un modello, la condizione cronica era chiaramente il nostro obiettivo per gli studi, come abbiamo notato che se gli animali non hanno il recupero della loro funzione AV dopo circa 12 h, il recupero non si è verificato., Come elencato nella Tabella 1, il blocco cardiaco acuto ha avuto successo in 8/8 conigli, come confermato dall’ECG e dalla verifica visiva della contrazione atriale continua senza successiva contrazione ventricolare coordinata. L’insorgenza del blocco cardiaco è stata immediata dopo l’iniezione di un’aliquota di 0,1-0,2 ml di formalina al 10% nel piano corretto. Tuttavia, il recupero del nodo AV entro 12 h si è verificato in rabbit 1, portandoci a sviluppare il dispositivo di guida dell’onda H, che è stato impiegato per gli animali rimanenti (3-8)., In questi animali, abbiamo trovato miglioramenti immediati nel localizzare il sito di iniezione desiderato e nel fornire l’injectate in un modo che creerebbe CHB a lungo termine come desiderato.

Ci sono stati due morti operative. Il primo (animale 2) si è verificato dopo che l’animale è stato estubato prima di riprendersi completamente dall’anestetico, poiché la stimolazione diaframmatica è stata male interpretata come respirazione. La seconda morte operativa (animale 4) aveva un’eziologia sconosciuta, ma era probabilmente secondaria a uno pneumotorace da tensione non diagnosticato. Non ci sono state infezioni correlate al dispositivo.,

I conigli, che sono sopravvissuti alla procedura, sono stati sacrificati a tempo prestabilito tra 1 e 2 settimane postoperatorie per l’esame. L’animale 5 è stato mantenuto per 37 giorni prima del sacrificio, come mezzo per giudicare il limite superiore della longevità animale. Il nostro obiettivo più ampio di indurre il blocco AV cronico (>durata 12 h) è stato raggiunto in 4 di 5 animali sopravvissuti utilizzando la guida dell’iniettore H-wave.

Nelle prime due settimane postoperatorie, gli animali hanno tollerato bene il loro blocco AV con un apporto nutrizionale sufficiente e una buona attività, anche se con un aumento di peso trascurabile., Nelle settimane successive, 2/7 conigli hanno sviluppato tachipnea progressiva e segni di sofferenza. Questi animali sono stati successivamente eutanasia. All’autopsia, entrambi sono stati trovati per avere massicce effusioni pleuriche bilaterali. L’ispezione grossolana del cuore, del torace e dell’addome di questi animali non ha rivelato altre anomalie.

Figura 1. A, iniettore modificato con punta piegata a 90°, profondità di iniezione di 5 mm e piombo di rame per la cattura del segnale., B, Sample electrocardiogram output, demonstrating the appearance of an H wave (white arrow), which indicates tip contact with the atrioventricular node.

Table 1. Experimental data for atrioventricular node ablation trials in adult rabbits.,

Discussione

Queste effusioni erano la patologia principale nei conigli con la sopravvivenza più lunga, e crediamo che fossero secondarie alla stimolazione dell’animale a una velocità insufficiente (180 bpm), riducendo così la gittata cardiaca. Avevamo notato un precedente rapporto (10) di conigli con CHB indotto che erano stimolati a tassi bassi come 140 bpm, con effetti negativi minimi a breve termine. Tuttavia, in quello studio è stata notata anche una diminuzione della gittata cardiaca e i conigli a ritmo di 140 bpm sono sopravvissuti solo per 8 giorni., Un modello di insufficienza cardiaca dopo la creazione di CHB con stimolazione insufficiente è stato precedentemente stabilito anche nei cani (11). Una diminuzione della gittata cardiaca potrebbe essere supportata dal ritrovamento della perdita di peso dei nostri animali, anche se questo potrebbe essere stato dovuto allo stress dell’intervento chirurgico. Sebbene esista la possibilità che le effusioni siano puramente reattive, è significativo che non abbiamo riscontrato grandi effusioni negli animali che sono stati sacrificati in precedenza.,

Abbiamo notato una frequenza cardiaca fisiologica di 200-300 bpm prima dell’intervento chirurgico, e i risultati di cui sopra suggeriscono che 180 bpm consente una sopravvivenza intermedia, ma alla fine potrebbe essere insufficiente per il modello. Da allora abbiamo riprogrammato i pacemaker per consentire il ritmo a questi tassi più elevati. I nostri primi esperimenti preliminari comprendevano comprensibilmente alcune morti chirurgiche dovute ai suddetti fattori., Queste morti operative e postoperatorie possono generalmente essere evitate con l’esperienza e la comprensione delle esigenze specifiche degli animali, e abbiamo visto continui miglioramenti nella sopravvivenza degli animali dopo aver impiegato le procedure riviste.

Come descritto sopra, i nostri esperimenti futuri si concentreranno sulle sostituzioni dei nodi AV ingegnerizzati dai tessuti. In questo scenario di intervento chirurgico di sopravvivenza, il blocco cardiaco verrà indotto con il nostro metodo chimico e l’animale verrà mantenuto su un pacemaker meccanico, imitando le condizioni cliniche. Al momento dell’induzione del CHB, verrà prelevato anche un campione di tessuto, ad es.,, dai tessuti cardiaci, scheletrici, o del midollo osseo, per fornire una fonte delle cellule per la costruzione tessuto-costruita. Questa impalcatura può essere coltivata in vitro fino a quando la densità cellulare, l’allineamento e lo stato di differenziazione sono sufficienti per il reimpianto. In questo modello, il pacemaker originale può essere acceso o spento per verificare se l’impianto ingegnerizzato può condurre indipendentemente il suo segnale. La nostra tecnica dell’iniettore troverà ancora l’utilità, prima del sacrificio animale, identificando ed ablando selettivamente la costruzione impiantata., Se il tessuto impiantato riesce a creare una connessione elettrica tra l’atrio e il ventricolo, la frequenza cardiaca dovrebbe nuovamente diminuire dopo che questo innesto è stato ablato.

In sintesi, abbiamo descritto un metodo migliorato per facilitare l’ablazione del nodo AV nel modello rabbit, attraverso la conferma esterna della posizione del nodo AV. Il nostro dispositivo di iniezione, con una punta di iniezione angolata, una distanza di iniezione fissa e una lettura dell’onda H, fornisce una guida fisica ed elettrica per raggiungere il sito di interesse., Queste caratteristiche riducono i danni inutili al tessuto cardiaco circostante e diminuiscono la quantità di formalina necessaria per creare CHB. Mentre il blocco AV acuto potrebbe essere rapidamente indotto con iniezioni NBF in tutti gli animali, il nostro obiettivo finale del blocco AV cronico è stato raggiunto con maggior successo attraverso l’uso di questo dispositivo di iniezione migliorato. Questo modello in vivo fornisce una risorsa necessaria per lo sperimentatore, per testare nuove terapie nel ripristino della conduzione AV.

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Ringraziamenti

Ringraziamo il Dott., Hernandez e il personale RSF al Memorial Research Center per bambini per l ” anestesia coniglio, gestione delle vie aeree e la cura degli animali eccellente. Tutte le attrezzature di pacemaking sono state generosamente donate da Medtronic (Minneapolis, MN, USA). D. A. Harrington riconosce con gratitudine il sostegno del Dr. Ralph e Marian C. Falk Medical Research Trust. Riconosciamo il sostegno finanziario da Children’s Memorial Hospital, Children’s Memorial Research Center.

Corrispondenza e note a piè di pagina

Ricevuto il 4 marzo 2009. Accettato il 20 ottobre 2009. Disponibile online 15 gennaio 2010.,e Brazilian Journal of Medical and Biological Research is partially financed by