Les détails d’une expérience d’électrophorèse sur gel d’agarose peuvent varier selon les méthodes, mais la plupart suivent une procédure générale.
Vidéo montrant l’assemblage de la plate-forme de chargement et l’exécution du gel.
Casting de gelEdit
Chargement des échantillons d’ADN dans les puits d’un gel d’agarose à l’aide d’un multi-canal de la pipette.,
le gel est préparé en dissolvant la poudre d’agarose dans un tampon approprié, tel que TAE ou TBE, pour être utilisé en électrophorèse. L’agarose est dispersée dans le tampon avant de le chauffer jusqu’au point d’ébullition proche, mais évitez l’ébullition. On laisse refroidir suffisamment l’agarose fondue avant de verser la solution dans un moule car le moule peut se déformer ou se fissurer si la solution d’agarose est trop chaude. Un peigne est placé dans le plâtre pour créer des puits pour le chargement de l’échantillon, et le gel doit être complètement réglé avant utilisation.
La concentration de gel affecte la résolution de l’ADN de la séparation., Le gel d’agarose est composé de pores microscopiques à travers lesquels les molécules se déplacent, et il existe une relation inverse entre la taille des pores du gel d’agarose et la concentration – la taille des pores diminue à mesure que la densité des fibres d’agarose augmente. Une concentration élevée en gel améliore la séparation des molécules D’ADN plus petites, tandis que l’abaissement de la concentration en gel permet de séparer les molécules D’ADN de grande taille. Le procédé permet de séparer des fragments allant de 50 paires de bases à plusieurs méga bases en fonction de la concentration de gel utilisée., La concentration est mesurée en poids d’agarose sur le volume de tampon utilisé (g/ml). Pour une électrophorèse sur gel d’agarose standard, un gel à 0,8% donne une bonne séparation ou résolution des gros fragments D’ADN de 5 à 10 Ko, tandis qu’un gel à 2% donne une bonne résolution pour les petits fragments de 0,2 à 1 Ko. 1% gels est souvent utilisé pour une électrophorèse standard. Les gels à pourcentage élevé sont souvent fragiles et peuvent ne pas se fixer uniformément, tandis que les gels à faible pourcentage (0,1-0,2%) sont fragiles et difficiles à manipuler. Les gels d’agarose à bas point de fusion (LMP) sont également plus fragiles que les gels d’agarose normaux., L’agarose à bas point de fusion peut être utilisé seul ou simultanément avec l’agarose standard pour la séparation et l’isolement de l’ADN. PFGE et FIGE sont souvent faites avec des gels d’agarose à pourcentage élevé.
chargement des échantillonsmodifier
Une fois que le gel a pris, le peigne est retiré, laissant des puits où les échantillons D’ADN peuvent être chargés. Le tampon de chargement est mélangé avec l’échantillon D’ADN avant que le mélange ne soit chargé dans les puits. Le tampon de chargement contient un composé dense, qui peut être du glycérol, du saccharose ou du Ficoll, qui augmente la densité de l’échantillon de sorte que l’échantillon D’ADN puisse couler au fond du puits., Si l’échantillon D’ADN contient de l’éthanol résiduel après sa préparation, il peut flotter hors du puits. Le tampon de chargement comprend également des colorants colorés tels que le xylène cyanol et le bleu de bromophénol utilisés pour surveiller l’avancement de l’électrophorèse. Les échantillons D’ADN sont chargés à l’aide d’une pipette.
ElectrophoresisEdit
gel d’Agarose plaque dans la cuve d’électrophorèse avec des bandes de colorants, en indiquant les progrès de l’électrophorèse. L’ADN se déplace vers l’anode.,
l’électrophorèse sur GEL D’Agarose se fait le plus souvent horizontalement en mode sous-marin, le gel de brame étant complètement immergé dans un tampon pendant l’électrophorèse. Il est également possible, mais moins courant, d’effectuer l’électrophorèse verticalement, ainsi qu’horizontalement avec le gel soulevé sur les pattes d’agarose à l’aide d’un appareil approprié. Le tampon utilisé dans le gel est le même que le tampon courant dans le réservoir d’électrophorèse, c’est pourquoi l’électrophorèse en mode sous-marin est possible avec le gel d’agarose.,
pour une résolution optimale de L’ADN supérieure à 2 kb en électrophorèse sur gel standard, 5 à 8 V/cm est recommandé (la distance en cm se réfère à la distance entre les électrodes, donc cette tension recommandée serait de 5 à 8 multipliée par la distance entre les électrodes en cm). La tension peut également être limitée par le fait qu’elle chauffe le gel et peut faire fondre le gel s’il est exécuté à haute tension pendant une période prolongée, en particulier si le gel utilisé est le gel d’agarose LMP. Une tension trop élevée peut également réduire la résolution, ainsi que provoquer des stries de bande pour les grosses molécules d’ADN., Une tension trop faible peut entraîner un élargissement de la bande pour les petits fragments d’ADN en raison de la dispersion et de la diffusion.
L’ADN n’étant pas visible à la lumière naturelle, la progression de l’électrophorèse est surveillée à l’aide de colorants colorés. Le cyanol de xylène (couleur Bleu Clair) comigrate de grands fragments D’ADN, tandis que le bleu de bromophénol (bleu foncé) comigrate avec les plus petits fragments. Les colorants moins couramment utilisés comprennent le rouge crésol et L’Orange G qui migrent avant le bleu bromophénol. Un marqueur D’ADN est également exécuté ensemble pour l’estimation du poids moléculaire des fragments d’ADN., Notez cependant que la taille d’un ADN circulaire comme les plasmides ne peut pas être mesurée avec précision à l’aide de marqueurs standard à moins qu’elle n’ait été linéarisée par digest de restriction, sinon un marqueur d’ADN surfondu peut être utilisé.
coloration et visualisationmodifier
le gel avec éclairage UV: L’ADN coloré avec du bromure d’éthidium apparaît sous forme de bandes orange éclatantes.
L’ADN ainsi que L’ARN sont normalement visualisés par coloration avec du bromure d’éthidium, qui s’intercale dans les rainures principales de l’ADN et fluorescent sous la lumière UV., L’intercalation dépend de la concentration d’ADN et ainsi, une bande à forte intensité indiquera une quantité plus élevée d’ADN par rapport à une bande de moins d’intensité. Le bromure d’éthidium peut être ajouté à la solution d’agarose avant qu’elle ne gèle, ou le gel D’ADN peut être coloré plus tard après électrophorèse. Destaining du gel n’est pas nécessaire mais peut produire de meilleures images. D’autres méthodes de coloration sont disponibles; des exemples sont le vert SYBR, le GelRed, le bleu de méthylène, le bleu crésyle brillant, le sulfate Bleu Nil et le violet cristal., SYBR Green, GelRed et d’autres produits commerciaux similaires sont vendus comme des alternatives plus sûres au bromure d’éthidium, car il a été démontré qu’il était mutagène dans le test D’Ames, bien que la cancérogénicité du bromure d’éthidium n’ait pas été établie. SYBR Green nécessite l’utilisation d’un transilluminateur à lumière bleue. L’ADN taché de cristal violet peut être vu sous la lumière naturelle sans l’utilisation d’un transilluminateur UV qui est un avantage, mais il peut ne pas produire une bande forte.
lorsqu’il est coloré avec du bromure d’éthidium, le gel est vu avec un transilluminateur ultraviolet (UV)., La lumière UV excite les électrons dans le cycle aromatique du bromure d’éthidium, et une fois qu’ils reviennent à l’état fondamental, la lumière est libérée, rendant l’ADN et le complexe de bromure d’éthidium fluorescents. Les transilluminateurs Standard utilisent des longueurs d’onde de 302/312 nm (UV-B), mais l’exposition de l’ADN au rayonnement UV pendant aussi peu que 45 secondes peut endommager l’ADN et affecter les procédures ultérieures, par exemple en réduisant l’efficacité de la transformation, de la transcription in vitro et de la PCR. L’exposition de l’ADN aux rayons UV doit donc être limitée., L’utilisation d’une longueur d’onde supérieure de 365 nm (gamme UV-A) provoque moins de dommages à l’ADN, mais produit également une fluorescence beaucoup plus faible avec le bromure d’éthidium. Lorsque plusieurs longueurs d’onde peuvent être sélectionnées dans le transillumineur, la longueur d’onde la plus courte serait utilisée pour capturer des images, tandis que la longueur d’onde la plus longue devrait être utilisée s’il est nécessaire de travailler sur le gel pendant une période prolongée.
l’appareil transilluminateur peut également contenir des dispositifs de capture d’image, tels qu’un appareil photo numérique ou polaroid, qui permettent de prendre ou d’imprimer une image du gel.,
Pour l’électrophorèse sur gel de protéines, les bandes peuvent être visualisées avec des taches de Coomassie ou d’argent.
Découper en gel d’agarose des tranches. Un équipement de protection doit être porté lors de l’utilisation D’un transilluminateur UV.
procédures en Avalmodifier
Les bandes D’ADN séparées sont souvent utilisées pour d’autres procédures, et une bande D’ADN peut être découpée dans le gel sous forme de tranche, dissoute et purifiée., Les Contaminants peuvent cependant affecter certaines procédures en aval telles que la PCR, et l’agarose à bas point de fusion peut être préférée dans certains cas car elle contient moins de sulfates pouvant affecter certaines réactions enzymatiques. Les gels peuvent également être utilisés pour des techniques de buvardage.