Funciones de la notocorda en el desarrollo de vertebrados

Patrón

La notocorda tiene varias funciones bien establecidas en los patrones de surroundingtissues. Como estas cuestiones se han examinado exhaustivamente en otros lugares (Cleaver y Krieg, 2001;Dodd et al., 1998; Hogan y Bautch, 2004; Holland et al., 2004), solo menciono algunos de los papeles principales aquí. Tal vez el mejor caracterizado es el agujero de la notocordia en el patrón del tubo neural., Una serie de experimentos que involucraron tanto el trasplante como la eliminación de la notocordia durante el desarrollo mostraron que la notocordia puede señalar la formación de la placa de piso, que es el destino más ventral de la médula espinal(Placzek et al., 1991; van Straaten et al., 1989; Yamada et al., 1991). Entre las señales secretadas por la notocordia se encuentran las proteínas Hedgehog (Hh). SonicHedgehog, en particular, induce una gama de destinos de la médula espinal ventral de manera agrada mientras que simultáneamente suprime la expresión de genes característicamente dorsales (Placzeket al., 1993; Yamada et al.,, 1993; Yamada et al.,1991). Reforzando y manteniendo eventos de desarrollo anteriores, las señales de notocordio también están involucradas en el establecimiento de la asimetría de LR; la ablación de la notocordio en Xenopus gastrulae resulta en la aleatorización de la asimetría (Danos y Yost,1995; Lohr et al.,1997). En teleosts, las señales de Hh derivadas de notocordios controlan la formación del mioseptum horizontal, así como la especificación de los destinos del músculo de contracción lenta (Barresi et al., 2000; Devoto et al.,1996). Las señales derivadas de notocordios son importantes para especificar la formación de la aorta dorsal (Cleaver etal., 2000; Fekany et al.,, 1999; Isogai et al., 2003; Lawson et al., 2002), así como para la especificación normal del campo cardíaco(Goldstein y Fishman, 1998).Finalmente, la notocordia es importante para el desarrollo normal del endodermo precoz y el páncreas (Cleaver andKrieg, 2001; Kim et al.,1997).

estructural

aunque los roles de patrón del notocordio son esenciales para el desarrollo normal de los vertebrados, el notocordio también tiene un papel estructural esencial.,El notocordio es el principal elemento esquelético axial del embrión cordado temprano;sin un notocordio completamente diferenciado los embriones no pueden alargarse (Odenthal et al., 1996; Saúde et al., 2000; Schulte-Merker et al., 1992; Schulte-Merker et al., 1994; Stemple et al., 1996; Talbot et al., 1995). Para muchas especies, esto resulta en la incapacidad de nadar adecuadamente, escapar de la depredación y alimentarse. Se ha obtenido cierta comprensión de esta función de la notocordia a partir de estudios de mutaciones del pez cebra(Driever et al., 1996; haffter et al., 1996)., Se identificaron varios loci implicados en la formación de notocordos en varias pruebas sistemáticas a gran escala para detectar mutaciones que afectan a la embriogénesis del pez cebra(Fig. 3) (Odenthal et al., 1996; Stemple et al., 1996). Como he discutido, algunos de los loci identificados en estas pantallas se han encontrado que son importantes para la formación del Modero de acordes, resaltando las funciones de señalización importantes del notocordio. La mayoría de los loci, sin embargo, han resultado ser profundamente importantes para los aspectos estructurales de la función notocordal.,

para entender la estructura de la notocordia, es útil considerar la notocordia como parte de un sistema mecánico requerido para la locomoción(Fig. 4). Los embriones de pez cebra, por ejemplo, son capaces de voltear sus colas dentro de 1 día de la fertilización, yhechar y nadar dentro de 3 días. Por analogía, la notocordia es como una manguera contra incendios, que posee una funda fuerte pero flexible que puede resistir altas presiones hidrostáticas. Considere entonces una situación en la que la manguera contra incendios se llena con balones de agua, cada uno empujando contra el otro y contra la vaina., En tal disposición, la manguera contra incendios sería alargada y rígida, pero capaz de doblarse en cualquier dirección. Finalmente, con cables corriendo a lo largo de la parte superior e inferior de la manguera contra incendios inflada, los cables resistirían cualquier flexión hacia arriba o hacia abajo de la manguera, y cualquier fuerza que actúe sobre la manguera contra incendios la desviaría lateralmente.Para el embrión de pez cebra, el equivalente de la manguera de fuego es la membrana basal Peri-notocordal y los globos de agua son las células de notocordio vacuoladas. Corriendo a lo largo de la parte superior de la notocordia está la placa de piso y a lo largo de la parte inferior está el hipocord., De acuerdo con este papel estructural, tanto la placa de piso como el hipocord expresan una variedad de proteínas del cartílago,como el colágeno tipo II (Yan et al.,1995). Además, las mutaciones en genes como oep y Cyclops (Ndr2-Zebrafish Information Network), que conducen a una pérdida sustancial de la placa del piso,también producen embriones con una curvatura profunda hacia abajo (Hatta, 1992; Hatta et al., 1991; Schier et al.,1997). Por lo tanto, aunque aún no está establecido directamente, es posible que la placa de piso y el hipocord actúen como cables en los respectivos lados dorsal y ventral de la notocordia.,

en el pez cebra, la formación de la membrana basal Peri-notocordal y el vacuolo se ven afectados por dos clases fenotípicas de mutaciones. Una clase, que originalmente se encontró que afectaba tanto el desarrollo de la notocordia como el del cerebro, comprende los loci ricos, gruñones y somnolientos. Estos loci se han encontrado recientemente para codificar la laminina de pez cebra α1 (tímido), lamininß1 (gruñón) y laminin γ1 (somnoliento), que son constituyentes de la membrana basal(Parsons et al., 2002) (S. M. Pollard, PhD thesis, University College London, 2002)., La segunda clase de mutaciones se encontró originalmente para afectar notocord y melanóforo desarrollo temprano en la embriogénesis, llevando finalmente a la muerte celular catastrófica a través de embriones mutados. Esta clase comprende sneezy, happy ydopey, que codifican, respectivamente, las cadenas α, β E y del complejo coatómero, que es un componente importante de la vía secretora y es esencial para la supervivencia de todas las células eucariotas(Coutinho et al., 2004). Normalmente se consideraría que el complejo de coatómeros cumple una función eucariótica., Es sorprendente que la pérdida de la actividad de los coatómeros en embriones de peces de cebra lleve a un fenotipo de notocordio. Una explicación es que elcoatómero se suministra maternalmente, y que la notocorda formadora se encuentra entre los primeros tejidos en los que la demanda secretora excede la oferta materna. Esta pérdida de actividad secretora conduce a la pérdida de la membrana basal de la notocordia y a una falla en la formación de vacuolas. Juntos, la laminina de pez cebra y los coatomermutantes resaltan la importancia de la estructura de la notocordia para su función.,

Lamininas y estructura de notocordio

Las Lamininas son complejos proteicos heterotriméricos obligados que consisten en cadenas Ana, β y γ, y son integrales a las membranas basales.La membrana basal son estructuras ubicuas con diversos roles, pero generalmente se asocian con un epitelio. Típicamente en una membrana basal, los trimers de laminina polimerizan para formar una malla, que está reticulada a una malla de colágeno typeIV por nidógenos(Colognato y Yurchenco,2000; Iozzo, 1998;Timpl y Brown, 1996;Yurchenco y O’Rear, 1994).,Además, las membranas basales están asociadas con heparina-sulfateproteoglicanos (Iozzo, 1998).Las membranas basales son importantes para definir los límites entre los tejidos, para señalizar entre las células y, en algunas situaciones,para proporcionar una barrera mecánica fuerte (Timpl y Brown, 1996). Este último papel es de particular importancia en el kidneyglomérulo, donde la membrana basal sirve como parte integral del aparato de filtración mientras soporta altas presiones hidrostáticas(Miner y Li, 2000). Esto es similar al papel que desempeña la membrana basal Peri-notocordal.,

Lamininas son diversas, lo que probablemente refleja sus diversas funciones. En los humanoshay cinco genes que codifican la laminina α, cuatro β y tres γ.A través de varias combinaciones de cadenas α, β y γ, se han identificado hasta 12 isoformas de laminina diferentes(Colognato y yurchenco,2000). En el pez cebra, hasta ahora, la mayoría de los genes de la laminina pueden encontrarse en secuencia genómica, aunque solo unos pocos han sido secuenciados como ADNc de longitud completa.,

la clonación posicional de los loci tímidos, gruñones y resbalosos del pez cebra llevó a la identificación de tres cadenas de laminina;α1, β1 y γ1 (Parsons etal., 2002) (S. M. Pollard, PhD thesis,University College London, 2002). Los fenotipos mutantes de grumpy y sleepy sonindistinguibles, mientras que el fenotipo tímido es siempre más débil.,Durante el desarrollo de embriones mutantes gruñones y somnolientos, el fenotipo de notocordio primero se hace evidente cuando las vacuolas no se forman correctamente y cuando los genes que se expresan característicamente por cordamesodermo, como el erizo equidna, no se extinguen, como lo harían durante la diferenciación normal de notocordio. El análisis microscópico electrónico de la membrana basal Peri-notocordal muestra que está completamente ausente en estos mutantes, y la tinción de anticuerpos muestra una falta completa de inmunorreactividad de laaminina 1 en los embriones mutantes gruñones y blandos más gravemente afectados., En los embriones mutantes tímidos más débiles, la membrana basal Peri-notocordal solo falta en las regiones afectadas anteriormente de la notocordia. En la parte posterior de estos embriones, elenotocord está normalmente diferenciado y tiene inmunorreactividad de laminina 1. Las diferencias entre tímido y gruñón o dormido se deben a una redundancia entre las cadenas α de laminina. La interrupción de la expresión de laminina4 en embriones mutantes tímidos, que carecen de laminina1, conduce al fenotipo notocordial severo visto en mutantes gruñones y resbalosos, y a una pérdida completa de la inmunorreactividad de laminina1 (S. M., Pollard, PhD thesis, University College London, 2002).

estas cuatro cadenas de laminina-α1, α4, β1 y γ1-participan en la formación de la membrana de base Peri-notocordal, y el cordamesodermo expresa el ARNm para cada cadena. Pero, ¿thenotochord cuenta solo para la laminina en su membrana basal? Esta cuestión ha sido abordada por un ensayo de injerto organizador. En estos experimentos, se injertó un organizador dorsal de tipo salvaje en la región ventral de un embrión mutantost, o viceversa, y los embriones hermanados resultantes se analizaron para la diferenciación morfológica de notocordios., Sorprendentemente, para ambos tejidos mutantes gruñones y somnolientos, ambos tipos de injertos llevaron al mismo resultado, una notocordia normalmente diferenciada (Parsons et al., 2002). Unanálisis de la inmunorreactividad de la laminina mostró que cuando un organizador de tipo salvaje se trasplanta en hospedadores mutantes, las proteínas de la laminina 1 rodean el cordón trasplantado. Por lo tanto, las lamininas pueden ser suministradas por fuentes notocordales extra o por la notocordia misma.

Hay alguna relación entre la diferenciación de la notocorda y thepresence de la membrana basal. Es probable que esto implique la señalización desde la membrana basal hasta el módem de acordes. El estado de diferenciación puede ser determinado por el análisis de la expresión génica. Por ejemplo, el equidnahedgehog, que es un homólogo del pez cebra del erizo Indio mamífero, se expresa normalmente en el cordamesodermo, pero cuando el notocord se diferencia y las vacuolas se inflan, la expresión del erizo equidna se extingue(Currie e Ingham, 1996)., En los mutantes, sin embargo, el erizo equidna se expresa persistentemente(Parsons et al., 2002). Por contraste, cuando el notocord mutante se desarrolla en un fondo de tipo salvaje, el notocord se diferencia normalmente, lo que sugiere que se recibe una señal que reside en la membrana del basamento. Una posibilidad es que la laminina en sí misma es elsignal. Hay muchos receptores de laminina en la superficie celular,pero la interrupción de varios de estos receptores no puede copiar el fenotipo de pérdida de función de laminina, aunque otros fenotipos son evidentes., Otra posibilidad es que otra señal que reside en la membrana basal sirve como un notocord differentiationcue. La presencia de proteoglicanos de sulfato de heparina en las membranas basales en general, y específicamente en las membranas basales de notocord, proporcionaría el contexto correcto para una variedad de proteínas solubles del factor de crecimiento. La naturaleza de la señal de diferenciación de notocord, sin embargo, sigue sin resolverse.

estos estudios muestran que la formación de una membrana basal peri-notocordal es esencial no solo para la estructura de la notocordia, sino también para la diferenciación adecuada de la notocordia., De hecho, la pérdida de varios otros genes que no son componentes de la membrana basal, per se, pero que afectan la formación de la membrana basal Peri-notocordal, también afecta la diferenciación de laenotocordia.

Coatómeros y estructura notocordal

Similar a los mutantes de laminina adormilada y gruñona, los mutantes sneezy, happy y dopey también son fenotípicamente indistinguibles (Coutinho et al.,2004)., En estos mutantes, la notocordia no logra diferenciarse, como se mide tanto por la expresión persistente de los genes marcadores tempranos, como por la falla en formar vacuolas normalmente infladas. Al igual que en los mutantes de laminina, la membrana basal no se forma correctamente. Sin embargo, a diferencia de los mutantes de laminina, a partir de aproximadamente 48 horas después de la fertilización, los mutantes estornudos, felices y mudos absorben la muerte celular extendida por apoptosis y los embriones se desintegran. Por clasificación posicional, identificamos que sneezy, happy y dopey codifican las proteínas del coatómero α, β y β’ del pez cebra(Coutinho et al.,, 2004).

siete subunidades de coatómeros, en combinación con la pequeña GTPasa Arf1, conforman la capa de vesículas COPI (Bannykh et al., 1998; Cosson y Letourneur, 1997; Lowe y Kreis, 1998; Nickel y Wieland,1998). En las células eucariotas, hay al menos tres sistemas de vesicularcoating. Las vesículas recubiertas de clatrina manejan la endocitosis y las vesículas recubiertas de copio median el transporte de carga secretora desde el endoplasmicreticulo hasta el Golgi., Se cree que las vesículas recubiertas de copias son en gran medida responsables del transporte retrógrado de enzimas dentro del Golgi que mantienen su polaridad, y de la maquinaria que transporta proteínas desde el Golgi de regreso al retículo endoplásmico rugoso (RER).

el análisis microscópico electrónico reveló dos características importantes de las células notocordales en mutantes de coatómeros de pez cebra (Coutinho et al., 2004).En primer lugar, la vía secretora está bloqueada, lo que resulta en acumulaciones masivas de materiales dentro del RER, y la interrupción del aparato de Golgi es evidente.,En segundo lugar, la membrana basal peri-notocordal no se forma. Normalmente, la membrana basal Peri-notocordal tiene una estructura trilaminar (Fig. 5). La capa más cercana a la membrana plasmática es un único material teñido de forma oscura con aparentes enlaces cruzados a la membrana plasmática subyacente. Distal a esta capa es una capa media de fibras orientadas en una dirección alrededor de la célula de notocordio, ydistal a esta es una capa externa de fibras orientadas en una dirección ortogonal. En los mutantes del coatómero, las dos capas externas no están presentes, pero a menudo se observa una capa interna distinta., Tinción con laminina 1 antibodisugiere que la capa interna comprende en gran medida laminina. Utilizando injertos dorsalorganizadores de tejido mutante en embriones de tipo salvaje, y viceversa, se investigó el origen embrionario de las dos capas externas de esta membrana basal. Aunque experimentos similares de injerto con mutantes de laminina mostraron que la laminina podría ser suministrada por el notocordio en sí o por fuentes extra-notocordales, los injertos de tejido mutante de coatómero muestran que tanto el fenotipo theRER como el de la membrana basal son autónomos del notocordio., Por lo tanto,mientras que la capa interna rica en laminina puede ser suministrada por los tejidos circundantes, las capas externas de la membrana basal Peri-notocordal son probables que las células notocordales las secreten por sí mismas.

el notocordio tiene dos características, una membrana basal gruesa y una vacuola,las cuales colocan una demanda inusual en la vía secretora. Las proteínas del coatómero son esenciales para todas las células y tanto las proteínas como los ARNm del coatómero se suministran por vía materna. Durante el desarrollo de tipo salvaje, los ARNm que codifican proteínas de coatómero se expresan en chordamesoderm a un alto nivel., De hecho, cuando se observa por In situhybridisation, coatomer mRNA expresión parece ser chordamesoderm-specificand tiene un patrón temporal y espacial similar a los genes como FLH. El alto nivel de expresión de los coatómeros en el moder del cordón en desarrollo es probable que sea zygótico, y por lo tanto proporciona alguna explicación de cómo las mutaciones en un gen esencial para la célula podrían conducir a defectos específicos de desarrollo temprano.